CN102272292A - 增加软骨形成祖细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明人公开了一种促进软骨、骨或韧带修复或者诱导软骨组织修复或再生的方法，所述方法包括增加ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物在软骨形成祖细胞——例如间充质干细胞——中的表达或活性。发明人还提供了一种经工程改造以增加ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性的软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞(MSC)。

Description

增加软骨形成祖细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及发育学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明更具体而言涉及一种促进软骨形成祖细胞--例如间充质干细胞--的软骨发生的多肽。
背景技术
再生医学的一个主要领域是干细胞在软骨组织工程和重建外科手术中的应用。干细胞与祖细胞不同之处在于干细胞能自我更新和多谱系分化，而祖细胞只能多谱系分化而不能自我更新(3)。正是这种自我更新的能力使得干细胞尤其可用于移植医学。用于软骨修复的干细胞可有两个主要来源：来自胚泡期胚胎的内细胞群的ES细胞和间充质干细胞(MSC)。
将ES细胞用于软骨再生的最明显的优点是ES细胞是可无限增殖并且在理论上可能能够为移植提供分化的软骨细胞和软骨祖细胞的无限供给。但是，ES细胞自发分化为多种谱系的倾向和ES细胞向软骨形成分化的定向分化的低效率仍然是它们用于再生医学的主要障碍。此外，移植受体内ES细胞的免疫原性和畸胎瘤形成的潜在问题也对这些细胞用于组织移植造成高风险。
间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓、脂肪组织、脐带血和其他组织中的成人多能干细胞，它有助于间充质组织如骨(bone)、软骨、脂肪、肌肉、韧带、腱和间质的再生(4-5)。因此，本文描述的方法和组合物可用于促进软骨修复或诱导此类组织的修复或再生。
MSC的一个可能用途在于整形外科中，因为有明显证据表明它们能够分化为骨和软骨(6-9)。由于MSC分化为骨和软骨的分化潜能以及对体外扩增和遗传操作需求相对简单，MSC是用于软骨修复的最具前景的干细胞类型之一。但是，MSC的自我更新和增殖能力非常有限，并且似乎随着年龄而降低(10-11)。此外，MSC在先离体后体内扩增过程中逐渐失去其干细胞特性。将MSC用于组织工程的主要限制是获得足够的细胞用于移植。这将显然限制它们用于治疗年龄相关的退行性软骨疾病--如骨关节炎。
公认的来自骨髓的MSC实际上是高度异质的群体，仅有限部分的细胞能够分化为软骨形成谱系。相反，它们由多能干细胞以及三能、双能和单能祖细胞的异质群体组成(12-13)。此外，来自不同患者的样本的软骨分化变异性也对它们的临床应用和就MSC相关基础问题进行的解释造成了很大不便。
发明内容
根据本发明的第一个方面，发明人提供了一种经工程改造以增加ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性的软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞(MSC)。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可表现出软骨形成标记物的表达增加。所述软骨形成标记物可包含2型胶原蛋白(COL2A1)。它可包含聚集蛋白聚糖。它可包含col10A1。它可包含Sox9。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可表现出软骨蛋白聚糖分泌增加。所述分泌增加可由阿辛蓝(Alcian blue)染色检测。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可表现出增强的修复软骨、骨或韧带缺损的能力。所述增强的能力可由对任何合适标记物的组织学分级来检测。这可包括细胞形态学、基质着色、表面规则性、软骨的厚度以及供体与宿主相邻软骨的整合度中的一种或多种。所述增强的能力可通过由Wakitani等人(1994)描述的组织学分级检测。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可表现出以上特征的任意结合。可将上文所列的特征与未经如此工程改造的软骨形成祖细胞--例如间充质干细胞--比较。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，或其祖细胞可被用这样的表达构建体转染，即该表达构建体可增加ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。所述表达构建体可包括慢病毒表达构建体。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可被诱导进入软骨细胞分化。可通过如Liu et al.，2007中描述的团块培养系统(pellet culturesystem)诱导其进入软骨细胞分化。所述系统包括令软骨形成祖细胞--例如间充质干细胞--形成团块，并且在含有10ng/ml转化生长因子(TGF)-β3、10-7M地塞米松、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbate-2-phosphate)、40μg/ml脯氨酸、100μg/ml丙酮酸盐(pyruvate)和50mg/ml ITS+Premix(Becton Dickinson、6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、1.25mg/ml BSA和5.35mg/ml亚油酸)的软骨形成培养基中培养。
可对所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，进行工程改造以增加任一种或多种以下物质的表达或活性：Nanog、Oct4、端粒酶、SV40大T抗原(SV40large T antigen)、HPV E6、HPV E7和Bmi-1。
本发明的第二个方面提供了一种包括或源自上文列出的软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)的细胞系。所述软骨形成细胞，例如间充质干细胞系，可包含可无限增殖的或经无限增殖的细胞系。
根据本发明的第三个方面，发明人提供了一种包含ZNF145序列或其片段、同源物、变体或衍生物的核酸，所述核酸能够编码包含软骨形成活性的多肽，用于治疗疾病方法中。所述核酸可包含表达载体。所述疾病可包括软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
本发明的第四个方面提供了一种包含ZNF145序列或其片段、同源物、变体或衍生物的多肽用于治疗疾病的方法中，所述ZNF145序列或其片段、同源物、变体或衍生物包含软骨形成活性。所述疾病可包括软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
根据本发明的第五个方面，发明人提供了一种包含上文列出的软骨形成祖细胞--例如间充质干细胞、上文列出的细胞系、上文列出的核酸或上文列出的多肽的药物组合物。
在第六个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括调节软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)中的ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。所述方法可包括增加ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。这样的增强可促进软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)的软骨发生。所述方法可包括下调ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。这样的下调可减少软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)的软骨发生。
本发明第七个方面提供了一种促进软骨、骨或韧带修复或者诱导软骨组织的修复或再生的方法。所述方法可包括增加软骨形成祖细胞例如间充质干细胞中的ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。
本发明第八个方面提供了上文列出的经工程改造的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞、上文列出的细胞系、上文列出的核酸、上文列出的多肽或上文列出的药物组合物用于治疗以下任一种病症的用途或者用于制备用于治疗以下任一种病症的药物组合物的用途：软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
根据本发明的第九个方面，发明人提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括上调在所述个体中的或所述个体的软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)中ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性，或者将表现出ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性增加的软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)给予需要这类治疗的个体。所述治疗可以是用于软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞，可包括上文列出的特征。
本发明的第十个方面提供了ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物作为软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)的软骨形成分化的标记物的用途。
在本发明的第十一个方面中，发明人提供了一种调节Sox9的表达或活性的方法，所述方法包括调节ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。
根据本发明的第十二个方面，发明人提供一种鉴定能够使软骨形成祖细胞进行软骨发生或者促进软骨形成祖细胞进行软骨发生的试剂的方法，所述软骨形成细胞例如间充质干细胞，所述方法包括使ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物与候选试剂接触并确定所述候选试剂是否与ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物结合，并且任选地确定ZNF145或其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性是否因此受到调节。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员能力范围的常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这样的技术在文献中有说明。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak andJames O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A；Synthesis and Physical Analysis of DNA  Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：PortableProtocol NO.I by Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：ALaboratory Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855.Handbook of Drug Screening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，andOther Reference Tools for Use at the Bench，Edited Jane Roskams andLinda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN0-87969-630-3。这些一般性文本每一篇均以引用的方式纳入本文。
附图说明
图1示出了在MSC分化为3个谱系期间ZNF的上调。
图1A.在分化为3个谱系的7天期间通过实时PCR定量ZNF145的表达，表明在分化为3个谱系期间ZNF145的上调。
图1B.在脂肪形成和骨发生的7天期间通过免疫荧光法将ZNF145的表达定位于核中，而ZNF145在对照MSC中不表达。
图1C.在团块培养下，在软骨发生的7天期间通过免疫荧光法将ZNF145的表达定位于核中，而ZNF145在对照MSC中未检测到。
图1D.在MSC的软骨发生期间ZNF145的表达模式。
图2示出了小干扰RNA(siRNA)介导的ZNF145基因沉默对MSC分化的作用。
图2A.MSC被具有ZNF145shRNA和GFP的慢病毒高效率地感染。
图2B.在团块培养下，ZNF145敲低的MSC软骨发生48小时后，通过实时PCR测量ZNF145和软骨形成标记物减少的效率，并与无插入物的对照相比较。
图2C.ZNF145敲低减缓了MSC向3个谱系的分化。将MSC以ZNF145shRNA感染并且诱导其进入脂肪形成持续14天，软骨发生持续28天和骨发生持续14天，通过实时PCR测量3个谱系的标记物，并与无插入物的对照相比较。
图2D.将ZNF145-敲低和对照MSC诱导进入脂肪形成持续14天、软骨发生持续28天和骨发生持续14天。通过分别在脂肪形成中用油红染色细胞内充满脂质的小滴、在软骨发生中免疫染色2型胶原和阿辛蓝染色硫酸蛋白聚糖基质以及在骨发生中茜素红染色钙沉积，评估ZNF145敲低对MSC分化的作用。与阴性对照相比，在所有3个分化通路中ZNF145-敲低MSC表现出染色显著减少。
图3.显示ZNF145过表达对MSC分化的作用。
图3A.通过慢病毒系统将ZNF145在MSC的核中过表达，而在未分化的MSC中未检测到ZNF145。
图3B.与无插入物的对照相比，ZNF145过表达增加了MSC向软骨和骨的分化。将ZNF145过表达MSC诱导进入骨发生持续14天和软骨发生持续28天，通过实时PCR测量骨发生和软骨形成标记物，并与无插入物的对照相比较。
图3C.将ZNF145过表达和对照MSC诱导进入软骨发生持续28天和骨发生持续14天。通过在软骨发生中免疫染色2型胶原和阿辛蓝染色硫酸蛋白聚糖基质以及在骨发生中茜素红染色钙沉积，评估ZNF145过表达对MSC分化的作用。与无插入物的对照相比，ZNF145过表达MSC在软骨和骨分化通路中显示出着色增加。
图3D和图3E.在MSC细胞系的骨发生中当ZNF145过表达时，通过AP测定的碱性磷酸酶活性增加。将ZNF145过表达MSC和对照MSC细胞系诱导进入骨发生维持14天，通过AP测定定量碱性磷酸酶活性，并与对照相比较。
图3D.AP染色显示ZNF145过表达引起骨发生中碱性磷酸酶染色增加。
图3E.AP测定显示ZNF145过表达引起骨发生中碱性磷酸酶活性增加。
图3F.与无插入物的对照相比，ZNF145过表达增加了体外MSC细胞系的软骨发生和骨发生。将ZNF145过表达的MSC细胞系诱导进入软骨发生持续28天和骨发生持续14天，通过实时PCR测量软骨形成和骨发生标记物，并与无插入物的对照相比较。
图3G.ZNF145过表达增加了MSC细胞系的软骨发生和骨发生。将ZNF145过表达MSC和对照MSC诱导进入软骨发生持续28天和骨发生持续14天。通过在软骨中进行免疫染色Col2A1和阿辛蓝染色硫酸蛋白聚糖基质以及在骨发生中茜素红S染色钙沉积，评估ZNF145过表达对MSC细胞系分化的作用。与无插入物的对照相比，ZNF145过表达MSC细胞系显示出对软骨形成和骨发生分化的染色增加。
图3H.在骨发生中由ZNF145过表达引起碱性磷酸酶(AP)染色增加。对ZNF145过表达和对照MSC细胞系诱导进入骨发生维持14天，通过AP染色确定碱性磷酸酶活性。
图3I.在MSC细胞系骨形成中ZNF145过表达时，通过AP测定的碱性磷酸酶活性增加。将ZNF145过表达细胞系和对照MSC细胞系诱导进入骨发形持续14天，通过AP测定定量碱性磷酸酶活性，并与对照相比较。
图4示出了通过微阵列的全基因表达分析。
图4A.对14312个探针进行皮尔逊相关分析(pearson correlationanalysis)，以将来自两个不同的个体的无插入物的对照MSC和ZNF145过表达MSC聚类。红色表示表达增加，而绿色表示表达减少。
图4B.在ZNF145过表达MSC中上调的基因。来自两个患者的ZNF145过表达MSC显示了类似的上调基因的表达谱。
图4C.通过RT-PCR证实微阵列数据。RT-PCR测定与微阵列数据一致。
图5示出了在未分化的MSC中由ZNF145过表达引起的Sox9上调。用慢病毒感染MSC用于过表达ZNF145和Sox9，将无插入物用作对照。结果显示ZNF145上调Sox9，而Sox9不调节ZNF145，表明ZNF145是Sox9的上游调节物。A，RT-PCR；B，蛋白质印迹分析。
图6.ZNF145在大鼠模型中改善骨软骨缺损的修复。
图6A、图6B和图6C。在团块培养下，将所述ZNF145过表达MSC和无插入物的对照MSC诱导进入软骨分化持续7天，然后将团块移植入大鼠膝的骨软骨缺损中维持6周。结果显示，在6周时，ZNF145组出现比无插入物的对照组更好且更早的骨软骨缺损修复。
图6A.40×放大。图6B.100×放大。图6C.依照Wakatani et al.(1994)进行评估，组织学分级显示，在6周时，ZNF145组和无插入物的对照组之间在软骨缺损修复方面有显著差异(＊P＜0.05)。
图6D、图6E和图6F。在团块培养下，将所述ZNF145过表达MSC和无插入物的对照MSC诱导进入软骨分化持续7天，然后将团块移植进入大鼠膝的骨软骨缺损中维持12周。结果显示，在12周时，ZNF145组出现比无插入物的对照组更好的骨软骨缺损修复和整合。
图6D.40×放大。图6E.100×放大。图6F.依照Wakatani et al.(1994)进行评估，组织学分级显示，在12周时，ZNF145组和无插入物的对照组之间在软骨缺损修复方面有显著差异(＊P＜0.05)。
具体实施方式
本发明是基于已被证明的事实，即ZNF145在调节软骨形成祖细胞例如间充质干细胞的软骨形成分化中起作用。
发明人证明了，小干扰RNA介导的ZNF145基因沉默可导致软骨形成特异性基的因表达降低。ZNF145过表达可增加基因例如2A1型胶原(col2A1)、聚集蛋白聚糖、SRY(性别决定区Y)-盒9(Sox9)和10A1型胶原(col10A1)的表达。因此，ZNF145表达可用作软骨发生的标记物。
发明人证明了，如通过微阵列确定的，在未分化的MSC中ZNF145的靶标包括Sox9、软骨连接蛋白1(cartilage linking protein 1，HAPLN1)和碱性磷酸酶(ALPL)。ZNF145过表达可增强Sox9的表达，而Sox9过表达不影响ZNF145的表达。这表明，ZNF145作为Sox9的上游调节物调节软骨发生。
在实施例中，将ZNF145过表达hMSC的异源移植至大鼠中显示，与无插入物的对照相比，ZNF145可更好地修复软骨缺损。这些发现表明，ZNF145疗法可用作软骨再生和修复的方案。还可将它用于再生和修复其他组织，例如骨和韧带。
因此，如本文中所述，核酸或多肽形式的ZNF145、能够上调ZNF145活性或表达的ZNF145的激动剂以及ZNF145过表达细胞(例如间充质干细胞)可用作软骨发生促进剂。
软骨发生促进剂
所述实施例表明，ZNF145及其激动剂可用于初始、保持或稳定软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)的软骨发生。
因此，发明人提供了多种软骨发生促进剂，所述软骨发生促进剂包括ZNF145、其激动剂和ZNF过表达细胞的任意结合物。所述ZNF145过表达细胞可包括被或曾经被工程改造以过表达ZNF145的软骨形成祖细胞。所述ZNF145过表达细胞可包括任何合适类型的细胞。它可包括间充质干细胞。它还可包括软骨细胞、脐带干细胞、骨髓基质细胞、脂肪基质细胞或源自骨膜或滑膜的软骨形成祖细胞。
发明人提供了用于诱导软骨发生的方法，所述方法包括给予治疗有效量的本文描述的软骨形成促进剂，和任选的可药用载体。
发明人描述了一种包含ZNF145核酸的软骨形成促进剂。所述软骨发生促进剂可包括ZNF145多肽。因此，发明人提供了ZNF145核酸和多肽用于医药--例如用于治疗退行性疾病--的用途。
本文描述的方法可导致软骨形成。它们可导致软骨形成，所述软骨形成进一步介导脊椎动物中新骨组织的形成。所述方法可用于软骨、韧带或骨生成、再生或修复。所述方法可用于需要任何这些目标的任何治疗。这样的治疗可用于软骨、韧带或骨的疾病、损伤例如创伤性损伤、损害等。
所述软骨发生促进剂可包括能够上调ZNF145活性或表达的试剂。对于本文的目的而言，能够上调ZNF145活性或表达的试剂一般称为ZNF145激动剂。一般而言，ZNF145激动剂可包括以小于1微摩尔的Kd与ZNF145结合的任何化学物质。如下文中详述，ZNF145激动剂可包括增强或提高ZNF145的任一种或多种活性或功能的化学物质。
ZNF145激动剂包括ZNF145的转录活化剂、翻译活化剂或翻译后活化剂。ZNF145激动剂还包括增强ZNF145与其靶序列的DNA结合或转录活化活性(或两者)的分子。如下文进一步详述，ZNF145激动剂可通过测试或筛选鉴别。
ZNF145激动剂的一个实例是ZNF145表达载体。ZNF145表达载体可用于上调细胞(例如间充质干细胞)中的ZNF145表达。表达载体的一个实例是包含调节序列和ZNF145编码序列的表达载体。可使用任何适用于所述宿主细胞的表达载体。例如，可将能够上调ZNF145表达的慢病毒载体转染至细胞例如软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)中。
所述软骨发生促进剂可用于促进任何合适的细胞或细胞类型的软骨发生。所述软骨发生促进剂可用于促进间充质干细胞软骨细胞、软骨软骨细胞(cartilage chondrocyte)、脐带干细胞软骨细胞、骨髓基质软骨细胞、脂肪基质软骨细胞、软骨形成祖细胞软骨细胞或其结合物的软骨发生。
所述软骨细胞可选自透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、青少年关节软骨细胞、成人关节软骨细胞及其结合物。所述软骨形成前体选自滑液囊(synovial capsule)软骨形成祖细胞、骨膜软骨形成祖细胞、胚胎干细胞软骨形成祖细胞及其结合物。
所述软骨发生促进剂可用于促进软骨形成祖细胞的软骨发生。所述软骨发生促进剂可用于促进间充质干细胞的软骨发生。
所述软骨发生促进剂可包括ZNF145过表达细胞。所述细胞可包括间充质干细胞。所述ZNF145过表达细胞可用作用于治疗的ZNF145的来源。它可用于生成软骨，所述软骨可用于修复。所述修复可以是用于软骨、骨或韧带。这样的细胞，例如其中ZNF145表达上调的间充质干细胞本身可用作药物。ZNF145过表达细胞可通过以下方式产生：转染、转化或以其他方式使ZNF145表达载体进入细胞例如间充质干细胞，培养所述间充质干细胞并且使ZNF145从中表达。细胞系可衍生自这样的细胞。所述细胞系可被转化或者被无限增殖化。如下文和实施例中详述，无限增殖化的方法包括表达端粒酶或者一种或多种病毒基因。
已经通过工程改造来表达端粒酶和/或病毒基因而被无限增殖化的ZNF145过表达细胞或细胞系可用于治疗或用于生产本文所描述的药物组合物。
可将所述ZNF145过表达间充质干细胞给予需要治疗的患者。用所述表达载体转染或以其他方式进入的所述间充质干细胞可来自任何来源。例如，所述细胞可取自随后将给予所述细胞的同一患者(同种移植)。
本文中描述的软骨发生促进剂一般可用于促进软骨发生。它们可用于促进细胞、组织、器官或个体中的软骨发生。它们一般可用于软骨组织的生成、修复或再生。它们一般可用于软骨生成、再生或修复。它们可用于骨生成、再生或修复。它们可用于韧带生成、再生或修复。
它们还可用于治疗其中软骨发生受到影响、缺陷性地减少、受到抑制或以其他方式受损的疾病。一般而言，所述方法可用于治疗与骨、软骨或韧带的结构或功能的缺失或损害相关的任何病症。
所述方法可用于治疗退行性疾病，例如其中软骨、骨或韧带被损害或缺损等的疾病。它们可用于预防或减缓这些疾病的发作。
退行性疾病在下文中进一步详述，并且可包括与软骨缺损、骨缺损、韧带缺损、年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病相关的疾病；。
所述软骨发生促进剂还可被用于治疗其中软骨、骨或韧带受到损害的损伤。这样的损伤可包括创伤性损伤或运动损伤。它可以包括创伤性损害。
可将上述软骨发生促进剂以任意结合物的形式给予需要治疗的患者。它们可以药物组合物的形式提供，所述药物组合物可包括一种或多种软骨发生促进剂的任意结合物。
发明人描述了一种包括以下步骤的方法：(a)分离细胞，例如间充质干细胞；(b)使所述细胞具有过表达ZNF145的能力，例如通过将ZNF145表达载体转染至所述细胞中；(c)体外培养所述细胞；并且(d)使扩增的细胞产生用于移植的透明样软骨组织或细胞群。
发明人描述了一种治疗个体的方法，所述方法包括向所述个体给予从至少一个供体收集的上文所述细胞，例如间充质干细胞。本文所用的“供体”是指成人、儿童、婴儿，或优选胎盘。所述方法可包括向个体给予从多个从供体收集并且合并的细胞。所述细胞可以是取自多个供体的软骨形成祖干细胞。当从多个供体收集时，所述多个剂量单位(其中“剂量单位”是来自单个供体的收集物)可在给予之前合并、惯序地给予或可交替地给予。
发明人还描述了一种产生用于软骨、骨或韧带修复的细胞的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞，以及使用说明书。
所述试剂盒可包括药物包。它可包括一个或多个容器，所述容器装有一种或多种本文描述的药物组合物的组分。任选与这样的容器相关的可以是：用于细胞培养的装置、装有细胞培养基或者一种或多种细胞培养基组分的一个或多个容器、用于递送本文描述的组合物的装置(例如，用于静脉注射本发明的组合物的装置)和/或由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的简介，所述简介反映人用药的制造、使用或销售的机构的批准。所述试剂盒可包括装有软骨形成组干细胞例如间充质干细胞的一个或多个容器和本文他处公开的装有ZNF145或其激动剂的一个或多个不同的容器。
ZNF145软骨发生促进剂的用途
发明人提供了包含这样的软骨发生促进剂的组合物，所述组合物可包括ZNF145、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞中的任何一种或多种。
发明人描述了治疗性组合物和这样的组合物用于治疗涉及异常组织形成的病症的用途，所述异常组织形成包括软骨形成、骨形成和韧带形成。所述治疗性组合物可用于治疗涉及异常软骨、韧带或骨形成的病症，以及与由疾病导致或由于创伤引起的异常骨骼发育相关的病症。
所述治疗性组合物可包括有效量的软骨发生促进剂。它们可以还包括可药用载体的药物组合物的形式提供。所述软骨发生促进剂包括对软骨、骨或韧带形成的刺激作用，并且可在脊椎动物中导致相关的骨发育。
所述软骨发生促进剂可用在用于在脊椎动物中刺激软骨、骨或韧带形成的方法中。这样的方法可包括给予所述脊椎动物可有效刺激软骨、骨或韧带的量的软骨发生促进剂。它可用在用于治疗受试者中受到损害的软骨、骨或韧带以及相关骨(associated bone)的方法中。这样的方法可包括给予所述受试者有效量的软骨发生促进剂。所述软骨发生促进剂可刺激软骨、骨或韧带修复和形成，这可介导相关的骨修复。
所述软骨发生促进剂可用在用于治疗受试者的关节炎的方法中。所述方法可包括向受试者给予有效量的软骨发生促进剂。因此，发明人提供了一种用于治疗受试者的关节炎的方法，包括向所述受试者给予以有效量的经软骨发生促进剂处理的软骨形成细胞。
发明人还提供了一种用于在脊椎动物中诱导软骨发生和相关骨骼发育的组合物，所述组合物包含软骨发生促进剂和可药用载体。还提供了一种用于植入脊椎动物中软骨、骨或韧带部位处的成形装置，所述装置包括可植入的生物相容性载体和分散在所述载体之中或之上的软骨发生促进剂。发明人描述了包含软骨发生促进剂和可药用载体的组合物用于在体外诱导软骨发生的用途。
可通过使软骨祖间充质细胞与软骨发生促进剂在体外接触，而从软骨祖间充质细胞生产软骨细胞。术语“软骨细胞”是指在体内引起正常软骨组织生长的细胞(如软骨、骨或韧带细胞)；这些细胞可合成并沉淀软骨的支持基质(主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成)。
发明人提供了一种用于修复与脊椎动物整形手术缺损、损伤或畸形相关的软骨、骨或韧带的可植入假体装置，所述装置包括：具有可植入至软骨、骨或韧带组织附近或之中的表面区域的假体植入物；放置于所述表面上的软骨发生促进剂组合物，其量足以促进所述表面中的软骨、骨或韧带生长增加。还描述了一种用于促进可植入假体装置在体内整合进入脊椎动物的靶软骨、骨或韧带中的方法，所述方法包括步骤：在所述假体装置表面提供包含软骨发生促进剂和可药用载体的组合物，将所述装置植入脊椎动物中这样的部位，即其中所述靶软骨、骨或韧带组织与所述假体装置的表面保持至少部分接触，接触时间足以使在所述靶软骨、骨或韧带组织与所述装置之间进行组织生长。
发明人提供了一种用于促进脊椎动物骨骼手术部位处的自然骨形成的方法，所述方法包括以下步骤：向所述骨骼手术部位递送软骨发生促进剂组合物，从而使得这样的递送可直接促进由软骨介导的新骨组织形成。
发明人描述了一种用于修复脊椎动物中源自创伤或手术的大区段骨骼裂隙和不愈合骨折的方法，所述方法包括向所述区段骨骼裂隙或不愈合骨折部位递送本文描述的软骨发生促进剂，从而使得这样的递送可促进介导新硬骨组织形成的软骨形成。
发明人提供了一种帮助可植入假体附着在软骨、骨或韧带部位并且保持所述假体在脊椎动物中的长期稳定性的方法，所述方法包括用软骨发生促进剂组合物包覆可植入假体的选定区域并且将所述包覆的假体植入所述软骨、骨或韧带部位，从而使得这样的植入可促进新的软骨、骨或韧带组织的形成并且间接地刺激骨形成。
发明人提供了一种在体内软骨、骨或韧带缺损部位产生软骨、骨或韧带的方法，所述方法包括：将软骨形成细胞群植入所述缺损部位，所述软骨形成细胞已在本文所述的软骨缺损促进剂存在的情况下在体外培养。
发明人提供了一种治疗以软骨、骨或韧带退化为特征的退行性关节病的方法，所述方法包括：将治疗有效量的本文所述的软骨发生促进剂递送至疾病部位。
可将包含至少一种本文所述的软骨发生促进剂的药物组合物局部施用于治疗部位，例如通过生物可降解海绵、凝胶、涂层或糊剂。适用的凝胶可以是胶原型凝胶，例如I型胶原。所述软骨发生促进剂还可用于处理整形外科或牙科植入物以增强或加速骨的整合。可将包含至少一种软骨发生促进剂的药物组合物直接局部施用于所需的骨整合的部位，或者作为植入物上的涂层。
所述软骨发生促进剂还可用于促进可植入假体装置的体内整合。一般而言，可将本文所述的软骨发生促进剂组合物施用于用于植入的合成骨移植物，从而使得所述组合物可刺激软骨、骨或韧带形成并且间接刺激骨形成。因此，所述组合物在整形外科产业中有多种应用。具体而言，在创伤修复、脊柱融合、重建手术、上颌面手术和牙科手术中有应用。所述软骨发生促进剂组合物刺激局部自然骨生长的能力可提供稳定性且迅速的整合，同时以身体正常细胞为基础的骨重塑过程缓慢地消溶选定的植入物并且以天然骨将其取代。适于体内使用的植入物通常是本领域技术人员已知的。
本文所述的软骨发生促进剂可用于软骨、骨或韧带和骨骼重建。在这样的应用中，所述软骨发生促进剂可用于软骨、骨或骨骼组织的先离体后体内组织工程，用于植入脊椎动物。在骨软骨自体移植物或同种异体移植物移植过程中可用软骨发生促进剂处理细胞(Minas etal.(1997)Orthopedics 20，525538)。在自体移植物移植中，可从患者(例如，从肋骨)取出软骨形成细胞或具有软骨形成潜能的细胞并且将其用于填充软骨损伤。替代方法包括在体外扩增这些细胞，然后将它们植入软骨损伤处。包含至少一种软骨发生刺激性的软骨发生促进剂的药物组合物可用于在移植前和/或在移植后通过关节内注射处理所述体外培养的细胞。使用本文所述的软骨发生促进剂组合物可消除与自体移植物移植所需的骨收集过程相关的疼痛和代价。此外，所述软骨发生促进剂组合物可以是采用合成方法制造的，从而可降低感染和疾病的传播可能性并且减少患者的免疫排斥可能性。
本文描述的软骨发生促进剂还可用于治疗关节炎，包括骨关节炎或其他类型的关节炎(包括类风湿性关节炎)。为了逆转或减缓以软骨、骨或韧带退化为特征的退行性关节病，可将包含至少一种软骨发生刺激性的软骨发生促进剂的药物组合物通过关节内注射或与透明质酸粘弹性补充物(viscosupplement)结合局部施用。所述组合物可以快速释放或缓慢释放制剂的形式提供。这样的组合物可用于具有例如退化的髋关节或膝关节的患者。
一般而言，所述软骨发生促进剂可用于刺激间充质前体细胞的体外软骨发生和软骨细胞的体外形成。这样的细胞培养材料和方法是本领域技术人员已知的。在体外用选定的软骨发生促进剂处理的细胞和组织可用于体内治疗或者可用于体外细胞测定系统。
例如，体内或体外软骨细胞扩增可用于软骨、骨或韧带修复。软骨形成祖细胞例如间充质干细胞可从例如个体的骨髓样本中取出。可培养所述分离的软骨形成祖细胞如间充质干细胞，并用ZNF145表达载体如慢病毒载体转染。它们可通过用端粒酶表达载体或病毒蛋白例如HPV E6、E7或Bmi-1转化而被无限增殖化。细胞系可衍生自这样的无限增殖的软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞。
然后，可将所述ZNF145过表达的软骨发生祖细胞例如间充质干细胞给予至患者的身体内。在此之前，可诱导它们进入软骨细胞分化，例如通过如Liu et al.，2007所描述的团块培养系统。
可将通过所述过程分离的离解细胞在无支持物支持的情况下培养以形成用于软骨修复的三维组织(美国专利No.6,235,316)。但是，通过该方法扩增的细胞可与合适的可生物降解聚合基质或水凝胶结合植入，以形成新的软骨组织。可使用各种基质，包括由例如纤维蛋白或藻酸盐的材料构成的聚合水凝胶(细胞悬浮在其中)和间隙为约40至200微米的纤维性基质。示例性聚合基质可在植入约1至2个月后降解；例如聚乳酸-乙醇酸共聚物(美国专利No.5,716,404)。可将所述基质在植入或植入前接种，使之血管化，然后以细胞接种(Cima et al.，1991；Vacanti et al.，1988；and Vacanti et al.，1988)。可将其他材料(例如可增强所植入组织血管化并且/或者抑制纤维化组织向内生长的生物活性分子)与所述基质植入，以增强更多正常组织的发育。
本文描述的药物组合物可与其他软骨形成刺激物--例如骨形态发生蛋白(BMP)特别是BMP-2和BMP-4、骨生成蛋白(OP)如OP-1和/或细胞因子结合使用，以增强和/或保持所述组合物的作用。蛋白质BMP和OP属于代表参与生长和分化以及组织形态发生和修复的蛋白质的TGF-β超家族。还应理解，本文描述的软骨发生促进剂组合物还可包括其他软骨诱导试剂或因子，所述其他软骨诱导试剂或因子被定义为任何天然或合成的有机或无机化学化合物或生物化学化合物或者刺激软骨发生的化合物的混合物。还应理解，本文所述软骨发生促进剂还可包括已知对软骨、骨或韧带生长和形成有刺激作用的其他生长因子。
软骨形成祖干细胞
发明人提供了ZNF145过表达细胞的用途。这样的细胞可包括软骨形成祖干细胞。这样的细胞可从胎盘分离(Kogler et al.，2004)。它们可包括骨髓间充质基质细胞(Mackay et al.，1998；Kavalkovick et al.，2002)、脂肪基质细胞(Huang et al.，2004)、滑膜(DeBari et al.，2004)和骨膜(DeBari et al.，2001)。
间充质干细胞
所述ZNF145过表达细胞可包括间充质干细胞。间充质干细胞及其用途在Barry FP，Murphy JM.Mesenchymal stem cells：clinicalapplications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol.2004；36：568-584中有描述。
ZNF145
本文描述的方法和组合物利用了ZNF145。ZNF145还被称为前髓细胞性白血病锌指蛋白、PLZF、Kruppel样锌指蛋白、锌指蛋白145(Kruppel样，在前髓细胞性白血病中表达)。它在Entrez基因数据库中作为GeneID：7704中有描述。
ZNF145是Krueppel C2H2型锌指蛋白家族的一员，编码在羧基末端包含9个Kruppel型锌指结构域的锌指转录因子。ZNF145位于核内，参与细胞周期进程，并与组蛋白脱乙酰酶相互作用。该基因座处异常基因重排的具体实例与急性前髓细胞性白血病(APL)有关。另外转录剪接变体已被表征。
ZNF145核苷酸序列的一个实例是NM_006006.4。ZNF145的另一核酸序列是NM_001018011。这两个序列代表人变体(1)和(2)，两者都被包括在本文所述的术语ZNF145之中。术语ZNF145还包括这类序列的同源物、衍生物、片段和变体。
ZNF145的核酸变体和同源物包括GenBank编号AF060568.1、AF076613.1、AF076615.1、AF076616.1、AP000908.4(109922..149132)、AP002518.3、AP002755.2(2007..109322)、CH471065.1、S60093.1、AB208916.1、AK126422.1、BC026902.1、BC029812.1、BM969145.1、BX648973.1、Z19002.1、EU446725.1、CCDS8367.1。除非上下文另有说明，每个这样的序列和它们的同源物、变体、衍生物和片段均被包括在术语“ZNF145”之中。
ZNF145的一个蛋白质序列是NP-005997.2。ZNF145的另一多肽序列是NP-001018011.1。两序列都可被描述为本文所使用的术语“ZNF145”。
ZNF145的多肽变体和同源物包括AAD03619.1、AAC32847.1、AAC32848.1、AAC32849.1、EAW67241.1、EAW67242.1、AAC60590.2、BAD92153.1、AAH26902.1、AAH29812.1、CAA79489.1、ABZ92254.1、Q05516.2、Q59H43、Q71UL5、Q71UL6、Q71UL7。除非上下文另有说明，每个上述序列以及它们的同源物、变体、衍生物和片段均被包括在术语“ZNF145”之中。
ZNF145序列可包括天然或野生型ZNF145的任一种或多种功能。ZNF145的功能包括DNA结合、金属离子结合、蛋白质同源二聚体化活性、特异性转录抑制因子活性和锌离子结合。对每种上述活性的测定是本领域中已知的。ZNF145参与的过程包括凋亡、中枢神经系统发育、中肾发育、髓样细胞分化的负调节、DNA依赖性、转录和泛素循环。
测试具体蛋白质是否参与任何这些过程的方法是本领域中已知的，具体在Bernardo et al.，2007，359(2)：317-322；Cook et al.，Proc NatlAcad Sci USA，1995，92(6)：2249-2253；Shaknovich et al.，Mol Cell Biol1998，18：5533-5545；Petrie et al.，Oncogene，2008May 26中有描述。
本文所用的术语“ZNF145”和“ZNF145序列”应理解为包括提及每个以上的序列以及提及它们的片段、同源物、衍生物和变体。ZNF145核酸、ZNF145多肽及其片段、同源物、衍生物和变体在本文他处有进一步详述。
ZNF145特性
下文改编自OMIM条目176797：包含锌指和Btb结构域的蛋白16；ZBTB16，还被称作锌指蛋白145；Znf145，前髓细胞性白血病锌指；Plzf、Plzf/Rara Fusion Gene，Included。
Chen等人(1993，J.Clin.Invest.91：2260-2267，1993)鉴定到11号染色体上的PLZF基因，所述PLZF基因作为患有急性前髓细胞性白血病(APL)的中国患者17号染色体上视黄酸受体-α基因(RARA；180240)和易位t(translocation t)(11：17)(q23；21)的融合配偶体(fusion partner)。Chen等人(1993，EMBO J.12：1161-1167，1993)描述了所述PLZF基因。
Reid等人(1995，Blood 86：4544-4552，1995)证明，小鼠PLZF在未分化的多潜能造血祖细胞中以最高水平表达，并且它的表达随着细胞变得更成熟和定型于各种造血谱系而降低。在人中，在成熟外周血单核细胞中缺乏PLZF蛋白表达，而在CD34+人骨髓祖细胞核中有高PLZF水平。与许多转录因子不同，这些细胞中的PLZF蛋白显示出不同的点状分布，表明它在核中的是区域化的。
Zhang等人(1999，Proc.Nat.Acad.Sci.96：11422-11427，1999)在PLZF基因的外显子1内鉴别到至少4种可变剪接物(AS-I、-II、-III和-IV)。AS-I在所测试的大部分组织中被检测到，而AS-II、-III和-IV分别存在于胃、睾丸和心脏中。尽管在AS-I和外显子1-6的外显子-内含子边界处的剪接供体信号和受体信号是经典的(gt-ag)，但是AS-II、-III和-IV具有非典型的剪接位点。然而，这些可变剪接保持了开放阅读框，并且可编码无重要功能结构域的同种型。在无AS-I的mRNA类型中，存在6.0kb的相对较长的5-prime UTR。Zhang等人(1999，见上文)确定了PLZF是从秀丽隐杆线虫(C.elegans)到人的高度保守基因。PLZF旁系同源序列出现在人基因组中。人染色体11q23和19上存在2MLL/PLZF样序列排列表明在进化过程中有同线复制。
基因功能
Kang等人(2003，J.Biol.Chem.278：51479-51483，2003)发现，人前髓细胞系中的内源PLZF是通过与SUMO1(601912)的缀合而被修饰，并且PLZF与SUMO1共定位于经转染的人胚肾细胞的核中。定点诱变将转录抑制结构域-2中的lys242鉴定为PLZF类泛素化(sumoylation)的位点。报告基因测定表明lys242的SUMO1修饰是PLZF的转录抑制所需要的，并且电泳迁移率变动测定表明类泛素化增加了PLAF的DNA结合活性。PLZF介导的对细胞周期的调节和对细胞周期蛋白A2基因(CCNA2；123835)的转录抑制也依赖lys242上PLZF的类泛素化。
Ikeda等人(2005，J.Biol.Chem.280：8523-8530，2005)发现，PLZF是所培养的OPLL(602475)韧带细胞成骨分化期间上调的24个基因之一。PLZF在被检查的所有韧带和间充质干细胞中成骨分化期间都高度表达。在人和小鼠间充质干细胞中通过小干扰RNA沉默PLZF基因减少了成骨细胞特异基因--例如碱性磷酸酶(ALPL；171760)、胶原1A1(COL1A1；120150)、Cbfa1(RUNX2；600211)和骨钙素(BGLAP；112260)--的表达。PLZF表达未受加入BMP2(112261)的影响，并且BMP2表达未受PLZF表达的影响。在小鼠间充质细胞系中，PLZF的过表达增加了Cbfa1和Col1a1的表达；另一方面，CBFA1过表达不影响Plzf的表达。Ikeda等人(2005，见上文)得出结论，PLZF在早期成骨分化中起作用，是CBFA1的上游调节物。
使用酵母双杂交分析和蛋白质pull-down测定，Rho等人(2006，FEBS Lett.580：4073-4080，2006)证明PLZF与EEF1A1(130590)的CCS3异构体相互作用。突变分析揭示，PLZF的抑制因子结构域2和锌指结构域是所述相互作用所需要的。在报告基因测定中CCS3是PLZF的转录作用所需要的。
Tissing等人(2007，Blood 109：3929-3935，2007)发现，与未接触的细胞相比，8小时的强的松龙处理改变了来自患有前体-B或T-急性成淋巴细胞白血病的儿童的白血病细胞中51个基因的表达。上调最高的3个基因是FKBP5(602623)、ZBTB16和TXNIP(606599)，它们分别上调35.4、8.8和3.7倍。
PLZF/RARA融合蛋白
Chen等人(1994，Proc.Nat.Acad.Sci.91：1178-1182，1994)克隆了编码PLZF-RARA嵌合蛋白的cDNA，并且研究了它们的反式激活活性。当PLZF-RARA融合蛋白被表达RARA和类维生素A受体α(RXRA；180245)的载体共转染时，观察到了“显性阴性”效应。在视黄酸敏感髓样细胞中观察到的这些异常的反式活化性质有力地表明了APL的分子发病机理中有融合蛋白。
Lin等人(1998，Nature 391：811-814，1998)报道了PLZF-RAR-α和PML-RAR-α(参见102578)与组蛋白脱乙酰酶复合物(参见605164)的联合有助于确定APL的发生和患者对类视黄醇发生反应的能力。与这些观察结果一致，组蛋白脱乙酰酶的抑制物可显著增强类视黄醇诱导的视黄酸敏感的分化，并且恢复视黄酸抵抗APL细胞系的类视黄醇反应。Lin等人(1998)得出结论，致癌视黄酸受体通过异常染色质乙酰化介导白血病生成，并且核受体辅因子的药理学操作可能是治疗人疾病的有用方法。
Grignani等人(1998，Nature 391：815-818，1998)证明，PML-RAR-α和PLZF-RAR-α融合蛋白都通过RAR-αCoR盒募集所述核共阻抑物(NCOR；参见600849)-组蛋白脱乙酰酶复合体。PLZF-RAR-α在PLZF氨基末端区域中包含第二视黄酸抗性结合位点。高剂量的视黄酸从PML-RAR-α，而不从PLZF-RAR-α释放组蛋白脱乙酰酶活性。NCOR结合位点的突变消除了PML-RAR-α阻断分化的能力，而抑制组蛋白脱乙酰酶活性可将PLZF-RAR-α的转录和生物学效应从视黄酸信号传递通路的抑制物转变为活化物。因此，Grignani等人(1998，见上文)得出结论，组蛋白脱乙酰酶的募集对APL融合蛋白的转化能力是至关重要的，并且视黄酸对PML-RAR-α和PLZF-RAR-α共阻抑物复合体稳定性的不同效应可确定APL对视黄酸的差异反应。
Guidez等人(2007，Proc.Nat.Acad.Sci.104：18694-18699，2007)将CRABP1(180230)鉴定为PLZF和RARA/PLZF融合蛋白的靶标。PLZF通过以下方式抑制CRABP1：增殖来自远距离内含子结合元件(intronic binding element)的染色质凝聚，最终沉默CRABP1启动子。尽管经典的PLZF/RARA癌蛋白质对PLZF介导的抑制无效应，交互易位的产物--RARA/PLZF--结合至此远距离结合位点，募集p300(EP300；602700)，并且诱导启动子低甲基化和CRABP1上调。类似的，表达两种融合蛋白的视黄酸抗性小鼠母细胞比仅表达Plzf/Rara的视黄酸敏感细胞表达更高水平的Crabp1。RARA/PLZF以CRABP1依赖性方式赋予类视黄醇敏感的急性髓细胞性白血病细胞系以视黄酸抗性。Guidez等人(2007)得出结论，由RARA/PLZF引起的CRABP1上调有助于白血病中的类视黄醇抗性。
生物化学特性
Ahmad等人(1998，Proc.Nat.Acad.Sci.95：12123-12128，1998)报道了PLZF的BTB结构域的晶体结构。所述BTB结构域(也被称作POZ结构域)是进化保守的蛋白质-蛋白质相互作用基序，所述基序出现在5至10％的C2H2型锌指转录因子的N末端。所述BTB结构域有转录抑制活性并且与所述组蛋白脱乙酰酶复合体的组分相互作用。后一结合可提供将所述转录因子与调节染色质构象的酶活性联系起来的机制。
基因结构
Zhang等人(1999，Proc.Nat.Acad.Sci.96：11422-11427，1999)对包含全部PLZF基因的201kb基因组DNA区域进行了测序。重复元件占19.83％，并且在此区域除了PLZF之外没有明显的编码信息。PLZF被发现包含6个外显子和5个内含子，并且所述外显子组织与蛋白质结构域非常一致。Zhang等人(1999，见上文)在外显子1中鉴定了至少4种可变剪接物(AS-I、-II、-III和-IV)。
Van Schothorst等人(1999，Gene 236：21-24，1999)确定了所述ZNF145基因包含7个外显子并且跨越至少120kb。所述未翻译的外显子1位于CpG岛中，并且数个SP1(189906)结合位点和GATA1(305371)结合位点位于外显子1的上游。
基因定位
Chen等人(1993，J.Clin.Invest.91：2260-2267，1993)通过FISH将所述PLZF基因定位于号染色体11q23.1。
细胞遗传学
几乎所有患有APL的患者都有染色体易位t(15；17)(q22；q21)。分子研究揭示了所述易位通过15号染色体上的前髓细胞性白血病基因(PML；102578)和17号染色体上的视黄酸受体-α基因(RARA；180240)之间的融合生成嵌合基因。Chen等人(1993，J.Clin.Invest.91：2260-2267，1993)报道了对患有APL并且有变体易位t(11；17)(q23；21)的中国患者的研究，其中染色体11q23.1上的PLZF基因被融合至17号染色体上的RARA基因。与t(15；17)APL类似，全反式视黄酸处理产生了早期白细胞增多，随后是髓样成熟，但是该患者过早死亡没有实现缓解。
Zhang等人(1999，Proc.Nat.Acad.Sci.96：11422-11427，1999)表征了由Chen等人(1993)报道的在有t(11；17)的标准(index)急性前髓细胞性白血病病例中的染色体断裂点和结合点。所述结果表明有DNA损伤修复机制参与。
动物模型
Cheng等人(1999，Proc.Nat.Acad.Sci.96：6318-6323，1999)用PLZF-RARA和NPM(164040)-RARA产生了转基因小鼠。PLZF-RARA转基因动物在生命早期(6只小鼠中有5只在3个月内)形成了慢性髓细胞性白血病样表型，而3只NPM-RARA转基因小鼠在生命相对后期(12至15个月)显示了从典型APL到慢性髓细胞性白血病的表型谱。与来自PLZF-RARA转基因小鼠的骨髓细胞相比，来自NPM-RARA转基因小鼠的骨髓细胞可由全反式视黄酸(ATRA)诱导进入分化。Cheng等人(1999，见上文)发现，所述2种融合蛋白在与核共受体的相互作用中有不同的配体敏感度，这可能是对ATRA的差异反应的内在分子机制。这些数据清楚地确立了PLZF-RARA和NPM-RARA的致白血病功能，以及融合受体/共阻抑物相互作用在发病机理中和在确定APL的不同临床表型中的重要性。
He等人(2000，Molec.Cell 6：1131-1141，2000)生成了在其前髓细胞中表达RARA-PLZF和PLZF-RARA的转基因小鼠。RARA-PLZF转基因小鼠并未患有白血病。但是，PLZF-RARA/RARA-PLZF双转基因小鼠患有具有典型APL特征的白血病。这些作者证明RARA-PLZF可干扰PLZF转录抑制，并且这对于APL的发病机理是至关重要的，因为在PLZF缺陷/PLZF-RARA突变体中和PLZF-RARA/RARA-PLZF转基因小鼠中的白血病是无法区分的。因此，癌症相关的易位的这两种产物在确定所述疾病的区别性特征中都是至关重要的。
Barna等人(2000，Nature Genet.25：166-172，2000)生成了Zfpl45-/-小鼠，并且证明了Plzf对于形成肢和中轴骨骼的图式发育(patterning)是必需的。所述基因的失活导致了影响肢的所有骨骼结构的图式发育缺陷，包括前肢骨骼元件同源异型转化为后肢结构。他们证明了Plzf在肢芽中作为生长抑制因子和促凋亡因子起作用。Abdominal B(Abdb)Hox基因复合体(参见142956)成员以及编码骨形态发生蛋白的基因(例如，112267)的表达在所述Zfp145-/-小鼠的正在发育的肢中被改变。所述小鼠还在整个中轴骨骼中表现出向前的同源转化(anterior-directed homeotic transformation)，以及相关的Hox基因表达的改变。因此，Plzf是中轴骨骼和附肢骨骼中的前肢-后肢图式发育的介导物，并且作为Hox基因表达的调节物起作用。
Barna等人(2002，Dev.Cell 3：499-510，2002)确定，Plzf-/-小鼠中的缺陷是由于Abdb Hoxd复合体空间上而不是时间上的失调。他们鉴定了Hoxd11(142986)中一些Plzf-结合位点，并证明通常在DNA环形成时Plzf结合Hoxd11基因组DNA片段成为二聚体或可能成为三聚体。Barna等人(2002)还发现了在Hoxd调节元件中远距离Plzf结合位点之间的远程相互作用的证据。Plzf介导了对Hoxd报告基因构建体的转录抑制，并且在不存在Plzf下，在Hoxd调节区域上乙酰基化的组蛋白有增加。Plzf在小鼠前肢微块培养物中显示对Hoxd报告基因的剂量依赖性转录抑制，但是在后肢微块培养物中没有抑制。Plzf还直接束缚DNA上的多冠状蛋白(polycomb protein)Bmil(164831)，所述多冠状蛋白Bmil拮抗肢的后端化信号。Barna等人(2002)得出结论，通过PLZF募集组蛋白脱乙酰基酶和多冠状蛋白可有利于常染色质转变为异染色质。
成体种系干细胞能够自我更新，组织再生并产生大量分化的后代。小鼠突变体“luxoid”(lu)自发形成并且被定位于9号染色体(Green，1955，J.Hered.46：91-99，1955)，并且最初因其半显性异常、隐性骨骼表型以及雄性不育表型而被表征(Forsthoefel，1958，J.Morphol.102：247-287，1958)。Buaas等人(2004，Nature Genet.36：647-652，2004)证明，小鼠突变体luxoid可影响成体种系干细胞自我更新。幼年的纯合luxoid突变体小鼠可产生有限数量的正常精子，然后在出生后进行性地失去它们的种系。移植研究表明，突变小鼠的生殖细胞未定殖于受体睾丸中，这说明所述缺陷是所述干细胞固有的。Buaas等人(2004)确定了所述luxoid突变体在Plzf基因上包含无义突变，Plzf基因是调节未分化细胞的外遗传状态(epigenetic state)的转录抑制物。此外，他们证明，Plzf在未分化的精原细胞中与Oct4(164177)共表达。据说这是第一个被发现的哺乳动物生殖细胞中干细胞自我更新所需要的基因。
Costoya等人(2004，Nature Genet.36：653-659，2004)同样证明，Plzf在精子发生中有关键的作用。所述基因的表达局限于性原细胞和未分化的精原细胞，并且不存在于缺少这些细胞的W/W(v)突变体的细管中。缺乏Plzf的小鼠随着年龄增长经历精原细胞的进行性丧失，伴随有凋亡增加以及随后的细管结构丧失，但无明显的分化缺陷或支持性滋养细胞丧失。精原细胞移植实验显示在成体中精原干细胞的耗尽。这些结果和其他结果将Plzf鉴定为调节干细胞群的自我更新和维持所需要的睾丸中精原细胞特异性转录因子。
Barna等人(2005，Nature 436：277-281，2005)鉴定了Gli3(165240)和Plzf之间的遗传相互作用，所述相互作用在肢发育的非常早期阶段是下肢(股骨、胫骨、腓骨)中所有近端软骨聚集部分(condensation)所特别需要的。明显地，在Gli3/Plzf双敲除小鼠胚胎中，包括足的远端聚集部分相对来说未受干扰。Barna等人(2005，见上文)证明，Gli3和Plzf的协同活性在近端肢芽中建立了不依赖于近端-远端(P-D)模式形成标记物和整体肢芽尺寸的软骨祖细胞的正确时间和空间分布。此外，所述双敲除胚胎中的肢缺陷与近端间充质细胞具体亚群的暂时性死亡有关，所述近端间充质细胞具体亚群在肢发育开始时表达1B型骨形态发生蛋白受体(Bmpr1b；603248)。Barna等人(2005，见上文)得出结论，近端和远端骨骼元件的发育在早期肢芽形成期间被不同地调节。脊椎动物肢最初分为两个不同分子区域，这与表明肢的上肢和下肢具有不同进化来源的化石证据相符合。
ZNF145多肽
本文描述的方法和组合物利用了ZNF145多肽，下文将对其进行详述。
本文使用的术语“ZNF145多肽”意欲指具有GenBank编号NP_005997.2(蛋白质变体1)或NP_001018011.1(蛋白质变体2)的序列。其他ZNF145多肽序列包括AAD03619.1、AAC32847.1、AAC32848.1、AAC32849.1、EAW67241.1、EAW67242.1、AAC60590.2、BAD92153.1、AAH26902.1、AAH29812.1、CAA79489.1、ABZ92254.1、Q05516.2、Q59H43、Q71UL5、Q71UL6和Q71UL7。
“ZNF145多肽”可包括人ZNF145多肽--例如具有编号NP_005997.2或NP_001018011.1的序列，或者由该多肽组成。
还包括这些多肽的任何、一些或所有同源物、变体和衍生物。例如，ZNF145可包括GenBank编号AAD03619。
ZNF145多肽可用于多种方法中，例如，给予患有或怀疑患有退行性疾病的个体以治疗所述疾病。它们还可用于产生或筛选抗ZNF145剂例如特异性ZNF145结合剂，尤其是抗ZNF145的抗体。这些将在下文进一步详述。可检测ZNF145多肽的表达以诊断或检测退行性疾病。
“多肽”是指包含两个或多个通过肽键或经修饰的肽键相互结合在一起的氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽电子等排体。“多肽”是指短链和长链，所述短链一般称为肽、寡肽或低聚体，所述长链一般称为蛋白质。多肽可包含所述20个由基因编码的氨基酸之外的氨基酸。
“多肽”既包括被天然加工--例如翻译后加工--修饰的氨基酸序列，又包括被本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这样的修饰在基础教材和更详细的专著以及众多研究文献中有很好的描述。修饰可出现在多肽中的任意位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应理解在给定的多肽中同类型的修饰可以相同或不同的程度在多个位点处出现。同样，给定的多肽可包含多种类型的修饰。
多肽可因泛素化而分支，并且它们可以是具有分支或不分枝的环。环形的、分支的或带分支的环形的多肽可产生于翻译后天然加工或可由合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成(GPIanchor formation)、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化(prenylation)、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸盐化、转运-RNA介导的向蛋白质加入氨基酸例如精氨酸化(arginylation)和泛素化。参见，例如，Proteins-Structureand Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York，1993and Wold，F.，Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects，pgs.1-12 in PosttranslationalCovalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter et al.，″Analysis for protein modifications andnonprotein cofactors″，Meth Enzymol(1990)182：626-646and Rattan etal.，″Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging″，Ann NYAcad Sci(1992)663：48-62。
术语“多肽”包括本领域中已知的多种合成肽变体，例如反转型(retroinverso)D肽。所述肽可以是抗原决定簇和/或T-细胞表位。所述肽在体内可以是免疫原性的。所述肽可能能够诱导在体内中和抗体。
当用于ZNF145时，所得氨基酸序列可以具有一种或多种活性，例如ZNF145多肽--例如人ZNF145多肽--中共有的生物活性。例如，与非软骨形成间充质干细胞相比，ZNF145同源物在软骨形成间充质干细胞中可以具有增加的表达水平。具体地，术语“同源物”包括关于结构和/或功能方面的同一性，条件是所得氨基酸序列具有ZNF145活性。关于序列同一性(即相似性)，可有至少70％，例如至少75％，例如至少85％，例如至少90％的序列同一性。可有至少95％，例如至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖源自所述ZNF145核酸序列等位基因变体的氨基酸的多肽。
如果提及多肽例如ZNF145的“活性”或“生物活性”，这些术语意欲指ZNF145的代谢或生理功能，包括相似活性或增强的活性，或者不良副作用减少的上述活性。还包括ZNF145的抗原活性和免疫原活性。这些活性的实例，以及测定和定量这些活性的方法是本领域中已知的，并且在本文他处有详述。
例如，这样的活性可包括以下任一种或多种：DNA结合、金属离子结合、蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、特异转录抑制物活性和锌离子结合、凋亡、中枢神经系统发育、中肾发育、髓样细胞分化的负调节、转录的负调节、DNA依赖性、转录和泛素循环。
其他ZNF145多肽
在本文描述的方法和组合物中还使用ZNF145变体、同源物、衍生物和片段。
与ZNF145有关的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、改变、修饰、替换或缺失，或者向序列任意添加一个(或多个)氨基酸。除非上下文另有说明，提及“ZNF145”时包括提及ZNF145的这类变体、同源物、衍生物和片段。
本文所用的“缺失”被定义为核苷酸或氨基酸序列中的改变，其中分别失去一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文所用的“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列的改变，与天然存在物质相比，所述改变分别导致增加一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文所用的“置换”产生自一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替换。
本文描述的ZNF145多肽还可具有产生沉默改变和生成功能相同的氨基酸序列的对氨基酸残基的缺失、插入或置换。主动的氨基酸置换可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性做出。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似亲水性值且具有不带电极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸
保守置换可根据例如下表产生。第二列同一格中的氨基酸和第三列同一行中的氨基酸可以相互置换：
ZNF145多肽还可包括异源氨基酸序列，一般在N-末端或C-末端，例如N-末端。异源序列可包括影响细胞内或细胞外蛋白寻靶的序列(例如前导序列)。异源序列还可包括增加所述ZNF145多肽的免疫原性并且/或者有利于鉴定、提取和/或纯化所述多肽的序列。可使用的另外的异源序列是多聚氨基酸序列，例如可以是N-末端的多组氨酸。可使用至少10个氨基酸，例如至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列。
所述ZNF145多肽可以是“成熟”蛋白质的形式或者可以是较大蛋白质例如融合蛋白的一部分。包括这样的额外氨基酸序列通常是有利的，即该序列包含分泌或前导序列、先导序列、协助纯化的序列(如多组氨酸残基)或在重组体产生期间用于稳定性的额外序列。
本文描述的ZNF145多肽可使用已知的技术有利地通过重组方式制备。但是，它们也可使用本领域技术人员公知的技术(如固相合成)通过合成方式制备。这样的多肽还可制备为融合蛋白，例如为了协助提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6×His、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。还可方便地在所述融合蛋白配偶体和所述目的蛋白序列之间包括蛋白水解切割位点，例如凝血酶切割位点。所述融合蛋白可以是不妨碍目的序列的蛋白质功能的融合蛋白。
所述ZNF145多肽可以是基本上分离的形式。该术语意欲指人工从天然状态的改变。如果“分离的”组合物或物质天然存在，那么它已经被从它原来的环境中改变或移出，或者同时改变并移出。例如，对于本文使用的术语“分离的”，天然存在于有生命动物中的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料中分离出来的相同多核苷酸、核酸或多肽是“分离的”。
但是，应理解所述ZNF145蛋白质可与不会干扰所述蛋白的预定目的的载体或稀释剂混合，并且所述蛋白质仍被认为是基本上分离的。ZNF145多肽还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下所述蛋白一般被包含在制剂中，其中所述制剂中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白质是ZNF145多肽。
通过比对来自不同物种的ZNF145序列，能够确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种之间是保守的(“同源区域”)，还有哪些区域在不同物种之间是不同的(“异源区域”)。
因此，所述ZNF145多肽可包括对应于同源区域的至少一部分的序列。同源区域在至少两个物种之间显示出高度的同源性。例如，使用上文描述的测验时，所述同源区域在氨基酸水平上可显示至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性。包含对应于同源区域的序列的肽可用于下文进一步详述的治疗方案中。或者，所述ZNF145肽可包含对应于同源区域的至少一部分的序列。异源区域在至少两个物种之间显示出低度的同源性。
ZNF145同源物
可使用的所公开ZNF145多肽包括从任何来源得到的同源序列，例如相关的病毒/细菌蛋白、细胞同源物和合成的肽以及它们的变体或衍生物。因此，多肽还包括那些来自其他物种的ZNF145的编码同源物，所述其他物种包括动物，例如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或兔)，尤其是灵长类，更尤其是人。更具体地，同源物包括人同源物。
在本文的上下文中，同源序列被认为包括这样的氨基酸序列，即所述氨基酸序列在氨基酸水平上与相关ZNF145序列具有至少15、20、25、30、40、50、60、70、80或90％的同一性(例如至少95或98％的同一性)，例如至少50或100、200、300、400或500个以上氨基酸。
具体地，一般应针对已知为蛋白质功能所必需的序列的那些区域而不是非必需邻近序列来考虑同源性。在考虑来自远缘生物的同源序列时，这一点尤其重要。
尽管同源性还可从相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)的方面来考虑，但在本文上下文中同源性可表示为序列同一性。
同源性比较可通过肉眼进行，或者更通常借助容易获得的序列比较程序进行。这些公众可获得的和市售的计算机程序可计算两个或多个序列之间的同一性百分数。
可对连续序列计算同一性百分数，即将一个序列与另一个序列进行比对，并将一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列中对应的氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“无空位”(“ungapped”)比对。一般地，这种无空位比对仅针对相对较少的残基(例如少于50个连续氨基酸)进行。
尽管这是非常简单且可靠的方法，但它未考虑到例如在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基从比对中出局，从而有可能在进行全局比对时导致同一性百分数大大减小。因此，大多数序列比较方法被设计为产生能够考虑到可能的插入和缺失而不过度处罚整体同源性得分的最优比对。这一点可通过在序列比对中插入“空位”而尝试使得局部同一性或相似性最大化来实现。
但是，这些更复杂的方法对出现在比对中的每个空位均给定“空位罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对--反映两个比较序列之间有更高的相关性--将比有很多缺口的序列比对得到更高的分值。通常使用“仿射空位分值”，它对空位的存在罚以相对高的分值，并对该缺口中的每个后续残基罚以较低的罚分。这是最常用的空位评分体系。高空位罚分当然将产生较少缺口的最优比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。但是，当使用这样的软件进行序列比较时，可使用默认值。例如，当使用GCG WisconsinBestfit程序包(参见下文)时，氨基酸序列的默认空位罚分是一个缺口为-12，每个延伸为-4。
因此，最大同一性百分数的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适于实施这样的比对的计算机程序是GCGWisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin，U.S.A；Devereux exal.，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。能实施序列比较的其他软件的实例包括但不局限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.，1999 ibid-Chapter 18)、FASTA(Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具程序包。BLAST和FASTA都能进行脱机或在线搜索(参见Ausubel et al.，1999ibid，第7-58至7-60页)。可使用GCG Bestfit程序。
尽管可就同一性计算最终同源性百分数，但比对过程本身一般并不基于全或无的配对比较。实际上，一般使用分级相似性评分矩阵，它基于化学相似性或进化距离对每对比较给出得分。这种矩阵的一个常用实例是BLOSUM62矩阵--用于BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般使用公开的默认值或定制的符号比较表(若提供)(更多细节参见用户手册)。可使用GCG程序包公开的默认值，或者在其他软件的情况下，可使用默认矩阵例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，就可能计算同源性百分数，例如序列同一性百分数。所述软件一般将其作为所述序列比较的一部分，并产生数字结果。
与氨基酸序列有关的术语“变体”或“衍生物”包括对所述序列的一个(或多个)氨基酸的任意置换、改变、修饰、替换或缺失，或者向所述序列任意添加一个(或多个)氨基酸，条件是所得的氨基酸序列基本上保持与所述未修饰的序列相同的活性，例如具有至少与ZNF145多肽相同的活性。
可对本文公开的具有ZNF145氨基酸序列的多肽或者其片段或同源物进行修饰，以用于本文描述的方法和组合物中。一般地，可进行保持所述序列的生物活性的修饰。可进行氨基酸置换，例如1、2或3至10、20、30个置换，条件是所述经修饰的序列保持所述未修饰的序列的生物活性。或者，可进行修饰以主动地失活本文描述的多肽的一种或多种功能结构域。氨基酸置换可包括使用非自然存在的类似物，例如为增加治疗性给药的多肽的血浆半衰期。
ZNF145片段
用于本文描述的方法和组合物的多肽还包括上文鉴定的任何ZNF145多肽全长序列的片段。片段可包括至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域中公知的。片段一般包括至少6个氨基酸，如至少10、20、30、50或100个氨基酸。
包括在内的有包含如下残基或由如下残基组成的片段：来自相关ZNF145氨基酸序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315或更多个残基。
本发明人还描述了包含本文描述的ZNF145多肽的一部分的肽。因此，ZNF145或其同源物、变体或衍生物的片段被包括在内。所述多肽可以长2至200个氨基酸，例如4至40个氨基酸。所述肽可源自本文公开的ZNF145多肽，例如通过用合适的酶(例如胰蛋白酶)消化。或者，所述肽、片段等可通过重组方式制备，或者通过合成方法合成。
这样的ZNF145片段可用于产生探针以优先地检测ZNF145表达，例如通过针对这些片段产生的抗体。预计这些抗体可特异性地结合ZNF145，并且可用于本文公开的检测、诊断和治疗方法中。
ZNF145及其片段、同源物、变体和衍生物可通过重组的方式制备。但是，它们还可使用本领域技术人员公知的技术(例如固相合成)通过合成方式制备。所述蛋白质还可制备为融合蛋白，例如以协助提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6×His、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。还可方便地在所述融合蛋白配偶体和所述目的蛋白序列之间包括蛋白水解切割位点，以使得可除去融合蛋白序列。所述融合蛋白可以是不妨碍目的序列的蛋白质功能的融合蛋白。还可通过纯化动物细胞的细胞提取物来得到蛋白质。
本文公开的ZNF145多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以是基本上分离的形式。应理解这样的多肽可与不会干扰所述蛋白的预定目的的载体或稀释剂混合，并且所述蛋白质仍被认为是基本上分离的。所述ZNF145变体、同源物、片段或衍生物还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下所述蛋白一般被包含在制剂中，其中所述制剂中超过90％，例如95％、98％或99％的所述蛋白质是一种蛋白质。
本文公开的ZNF145多肽、变体、同源物、片段和衍生物可用显示标记物标记。所述显示标记物可以是使所述多肽等可被检测到的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素例如125I、酶、抗体、多核苷酸和接头例如生物素。经标记的多肽可用在诊断性方法(例如免疫测定)中以确定样本中多肽的量。多肽或经标记的多肽还可被用在血清学测定或细胞介导的免疫测定中，用于使用常规方案检测动物和人中对所述多肽的免疫反应性。
还可将任选被标记的本文公开的所述ZNF145多肽、变体、同源物、片段和衍生物固定于固相上，例如免疫测定孔或浸渍片的表面。可将这样经标记和/或固定的多肽在合适的容器中与合适的试剂、对照物、说明书等一起包装为试剂盒。这样的多肽和试剂盒可用在通过免疫测定检测针对所述多肽或其等位基因或物种变体的抗体的方法中。
免疫测定法是本领域中公知的，一般包括：(a)提供这样的多肽，即该多肽包括可被其抗体结合的表位；(b)在可形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样本和所述多肽一起孵育；并且(c)确定是否形成包含所述多肽的抗体-抗原复合体。
针对ZNF145的抗体是本领域中已知的，并且可市购，例如来自加拿大安大略米西索加Anogen的兔抗-人PML多克隆抗体-a(Catalogue No AI70002A)和兔抗-人PML多克隆抗体-b(AI70002B)。
本文公开的ZNF145多肽、变体、同源物、片段和衍生物可用在体外或体内细胞培养系统中，以研究它们的相应基因及其同源物在细胞功能(包括它们在疾病中的功能)中的作用。例如，可将经截短或修饰的多肽引入细胞，以破坏出现在所述细胞中的正常功能。可通过原位表达来自重组表达载体的所述多肽将所述多肽引入所述细胞(见下文)。所述表达载体任选地带有可诱导启动子以控制所述多肽的表达。
使用合适的宿主细胞(例如昆虫细胞或哺乳动物细胞)预计可提供这样的翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化(lapidation)以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是将最佳生物活性赋予重组表达产物所必需的。这样的细胞培养系统(本文公开的ZNF145多肽、变体、同源物、片段和衍生物在其中表达)可用于测定系统中，以鉴定在所述细胞中干扰或增强所述多肽功能的候选物质。
ZNF145核酸
本文描述的方法和组合物可使用ZNF145多核苷酸、ZNF145核苷酸和ZNF145核酸以及任何这些物质的变体、同源物、衍生物和片段作为检测ZNF145表达水平的方式。此外，本发明人公开了可用于本文描述的诊断方法的具体ZNF145片段。所述ZNF145核酸还可用于所述治疗或预防方法。
术语“ZNF145多核苷酸”、“ZNF145核苷酸”和“ZNF145核酸”可互换使用，并且应被理解为明确地包括cDNA和基因组ZNF145序列。这些术语还意欲包括能够编码ZNF145多肽和/或其片段、衍生物、同源物或变体的核酸序列。
当提到ZNF145核酸时，这应被认为提及ZNF145核酸家族的任何成员。示例性ZNF145核酸包括NM_006006.4(mRNA变体1)和NM_001018011(mRNA变体2)。其他ZNF145核酸包括GenBank编号AF060568.1、AF076613.1、AF076615.1、AF076616.1、AP000908.4(109922..149132)、AP002518.3、AP002755.2(2007..109322)、CH471065.1、S60093.1、AB208916.1、AK126422.1、BC026902.1、BC029812.1、BM969145.1、BX648973.1、Z19002.1、EU446725.1和CCDS8367.1。
还包括下文作为“其他ZNF145核酸序列”列出的任一种或多种核酸序列。
例如，ZNF145核酸可包括具有GenBank编号NM_006006.4或NM_001018011(mRNA变体2)的人ZNF145序列。
ZNF145核酸可用于多种方法，例如，给予患有或疑似患有退行性疾病的患者以用于治疗所述疾病。可为检测软骨形成间充质干细胞而检测ZNF145核酸的表达。ZNF145核酸还可用于表达和产生ZNF145多肽。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者是经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不局限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区域混合物的RNA以及包含可以是单链DNA和RNA、更通常是双链DNA和RNA或者是单链和双链区域混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或者DNA和RNA两者的三链区域。所述术语多核苷酸还包括包含一个或多个经修饰碱基的DNA或RNA以及为稳定性或其他原因带有经修饰的主链的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和不常见碱基例如肌苷。对DNA和RNA制备了多种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖在自然界常见的多核苷酸的化学、酶法或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还涵盖相对短的多核苷酸，常被称为寡核苷酸。
本领域技术人员应理解，由于遗传密码子的简并性多种核苷酸序列可编码相同的多肽。
本文所用的术语“核苷酸序列”是指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其一部分)。所述核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的DNA或RNA，所述DNA或RAN可以是双链、代表正义或反义链的单链或者是其结合。术语核苷酸序列可通过使用重组DNA技术(例如，重组DNA)来制备。
术语“核苷酸序列”可指DNA。
其他核酸
发明人还提供了作为ZNF145核酸的片段、同源物或衍生物的核酸。与ZNF145核酸有关的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对ZNF145核苷酸序列的一个(或多个)核酸的任意置换、改变、修饰、替换或缺失，或者向ZNF145核苷酸序列任意添加一个(或多个)核酸。除非上下文另有说明，提及“ZNF145”和“ZNF145”时包括提及ZNF145的这类变体、同源物、衍生物和片段。
所得核苷酸序列可编码具有任意一种或多种ZNF145活性的多肽。术语“同源物”可意在涵盖有关结构和/或功能方面的同一性，使得所得到的核苷酸序列可编码具有ZNF145活性的多肽。例如，与非软骨形成间充质干细胞相比，ZNF145的同源物等在软骨形成间充质干细胞中可以有增加的表达水平。关于序列同一性(即相似性)，可有至少70％，至少75％，至少85％或至少90％的序列同一性。可与相关序列(例如，具有GenBank编号NM_015472的ZNF145序列)有至少95％，例如至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖所述序列的等位基因变体。
变体、衍生物和同源物
ZNF145核酸变体、片段、衍生物和同源物可包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们还可以是在其中包括合成的或经修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型修饰是本领域中已知的。这些包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本文的目的而言，应理解所述多核苷酸可被本领域中可用的任何方法修饰。可为增强目的多核苷酸的体内活性或寿命进行这类修饰。
当所述多核苷酸是双链时，双链体的两条链(单独地或结合地)被本文描述的方法和组合物所涵盖。当所述多核苷酸是单链时，应理解所述多核苷酸的互补序列也被包括在内。
与核酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括对所述序列的一个(或多个)核酸的任意置换、改变、修饰、替换或缺失，或者向所述序列任意添加一个(或多个)核酸。所述变体、同源物或衍生物可编码具有生物活性的多肽。如上所述，ZNF145的这类片段、同源物、变体和衍生物可包含经调整的活性。.
如上文指出的，关于序列同一性，“同源物”与相关序列(例如具有GenBank编号NM_015472的ZNF145序列)可具有至少5％的同一性、至少10％的同一性、至少15％的同一性、至少20％的同一性、至少25％的同一性、至少30％的同一性、至少35％的同一性、至少40％的同一性、至少45％的同一性、至少50％的同一性、至少55％的同一性、至少60％的同一性、至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。
可有至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性或至少99％的同一性。核苷酸同一性比较可如上文所述进行。可以使用的序列比较程序有上文描述的GCG WisconsinBestfit程序。所述默认评分矩阵对每个相同的核苷酸有10的匹配值，对每个错配为-9的匹配值。对于每个核苷酸，默认空位产生罚分是-50，默认空位延伸罚分是-3。
杂交
本发明人还描述了能与本文显示的任何序列或其任何变体、片段或衍生物，或者与上述任何序列的互补物选择性杂交的核苷酸序列。核苷酸序列长度可为至少15个核苷酸，如长度为至少20、30、40或50个核苷酸。
本文使用的术语“杂交”应包括“核苷酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及聚合酶链式反应技术中进行的扩增过程。
能够与本文显示的核苷酸序列或其互补物选择性杂交的多核苷酸与本文显示的对应核苷酸序列(例如，具有GenBank编号NM_015472的ZNF145序列)可以是至少40％同源、至少45％同源、至少50％同源、至少55％同源、至少60％同源、至少65％同源、至少70％同源、至少75％同源、至少80％同源、至少85％同源、至少90％同源或至少95％同源。这样的多核苷酸与所述对应核苷酸序列在至少20，例如至少25或30，例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸区域上一般可以是至少70％、至少80％或90％或者至少95％或至少98％同源。
术语“选择性地杂交”是指作为探针使用的多核苷酸是在其中靶多核苷酸被发现与所述探针以显著高于背景的水平杂交的条件下使用。背景杂交可能会由于其他多核苷酸的存在而出现，例如在被筛选的cDNA或基因组DNA文库中的其他多核苷酸。在该事件中，背景是指由所述探针和所述文库中非特异性DNA成员相互作用产生的信号水平，该水平是使用靶DNA观察到的特异性相互作用强度的10分之一，例如100分之一。相互作用的强度可通过例如放射性标记所述探针进行测量，例如用32P或33P或用非放射性探针(例如，荧光染料、生物素或地高辛)标记所述探针。
杂交条件是基于所述核酸结合复合体的解链温度(Tm)，这在Berger and Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol 152，Academic Press，San Diego CA)中有教导，并给出如下文所解释的确定“严格度”。
最高严格度一般出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格度出现在比Tm低约5℃至10℃；中严格度出现在比Tm低约10℃至20℃；低严格度出现在比Tm低约20℃至25℃。如本领域技术人员应理解的，最高严格度杂交可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而中(或低)严格度杂交可用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
本发明人提供了在严格条件(例如，65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0))下可能能够与所述ZNF145核苷酸、片段、变体、同源物或衍生物杂交的核苷酸序列。
同源物、变体和衍生物的产生
与所述相关序列(例如，具有GenBank编号NM_015472的人ZNF145序列)非100％相同但也被包括在内的多核苷酸，以及ZNF145的同源物、变体和衍生物可由多种方式获得。所述序列的其他变体可通过例如探测从一系列个体(例如来自不同群体的个体)制得的DNA文库获得。例如，ZNF145同源物可从其他个体或其他物种鉴定。其他的重组ZNF145核酸和多肽可通过鉴定所述同源物中的对应位置，并且合成或产生本文他处描述的分子来产生。
此外，可得到ZNF145的其他病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳细胞(例如，大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中出现的细胞同源物，这样的同源物及其片段通常能够与人ZNF145选择性杂交。这样的同源物可用于设计非人ZNF145核酸、片段、变体和同源物。诱变可通过本领域已知的方式进行，以产生其他的种类。
ZNF145同源物的序列可通过如下方式得到：探测从其他动物物种制备的cDNA文库或来自其他动物物种的基因组DAN文库，以及在中至高严格度条件下用包含任何ZNF145核酸、片段、变体和同源物或ZNF145的其他片段的全部或一部分的探针探测这样的文库。
类似的原则适用于获得本文公开的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和菌株/物种同源物还可使用简并PCR获得，所述简并PCR使用设计为靶向所述ZNF145核酸序列内编码保守氨基酸序列的变体和同源物中的序列的引物。保守序列可被预测，例如通过比对来自一些变体/同源物的氨基酸序列预测。序列比对可使用本领域中已知的计算机软件来进行。例如，GCG Wisconsin PileUp程序被广泛使用。
简并PCR中使用的引物将包括一个或多个简并位点，并且使用的严格度条件低于用于从已知序列以单序列引物克隆序列的严格度条件。本领域技术人员应理解，来自远缘生物序列之间的全局核苷酸同源性可能很低，因此在这些情况下可以选择简并PCR这种方法，而不是使用所述ZNF145序列的经标记片段筛查文库。
此外，同源序列可通过使用搜索算法例如BLAST软件包搜索核苷酸和/或蛋白质数据库进行鉴定。
或者，这类多核苷酸可通过对已表征的序列--例如ZNF145核酸或其变体、同源物、衍生物或片段--进行定向诱变得到。这在以下情况下可能是有用的：例如需要对序列进行沉默密码子改变，以针对所述多核苷酸序列在其中表达的具体宿主细胞优化密码子偏好。可能需要其他的序列改变，目的是为了引入限制性内切酶识别位点，或者为了改变由所述多核苷酸编码的所述多肽的性质或功能。
本文描述的多核苷酸可用于产生引物例如PCR引物、用于交替扩增反应(alternative amplification reaction)的引物、探针例如通过使用放射性或非放射性标记物的常规方法以显示标记物标记的探针，或者所述多核苷酸可克隆入载体。这样的引物、探针或其他片段长度为至少8、9、10或15，例如至少20，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也被本文使用的术语“多核苷酸”所涵盖。
多核苷酸例如DNA多核苷酸和探针可通过重组方法、合成方法或本领域技术人员可用的任何方法产生。还可通过常规技术克隆它们。
一般而言，引物可通过合成方法产生，包括每次一个核苷酸逐步制造所需的核酸序列。用于使用自动化技术实现这一点的技术在本领域中是可容易得到的。
包含ZNF145的片段的引物尤其可用于检测ZNF145表达的方法中，例如ZNF145表达的上调，例如与软骨发生有关时。合适用于扩增ZNF145的引物可从ZNF145的任何合适区段生成。可使用的引物包括能够扩增具体ZNF145序列的引物。
尽管ZNF145引物可能以其自身提供，但最常用的是将它们提供为引物对，包括正向引物和反向引物。
较长的多核苷酸通常可使用重组方法产生，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将包括：制备引物对(例如，约15至30个核苷酸的引物)，将所述引物与从动物或人细胞中得到的mRNA或cDNA接触，在可扩增所需区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离所扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化所述反应混合物)并回收所扩增的DNA。可将所述引物设计为包含合适的限制性内切酶识别位点，使得所扩增的DNA可被克隆到合适的克隆载体中。
多核苷酸或引物可带有显示标记物。合适的标记物包括放射性同位素如32P或35S、地高辛、荧光染料、酶标记物或其他蛋白质标记物例如生物素。可以将这样的标记物加至多核苷酸或引物，并且其本身可通过使用已知的技术检测。经标记的或未经标记的多核苷酸或引物或其片段可被本领域技术人员用在以核酸为基础的测验中，用于检测或测序人或动物体中的多核苷酸。
这类用于检测的测试一般包括：将包含DNA或RNA的生物样本与包含多核苷酸或引物的探针在进行杂交的条件下接触，并检测在所述探针和所述样本中的核酸之间形成的任何双链体。这样的检测可通过如下方式实现：使用例如PCR的技术或通过将所述探针固定在固体载体上，除去所述样品中不与所述探针杂交的核酸，然后检测与所述探针杂交的核酸。或者，可将所述样本核酸固定于固体载体上，并且可以检测结合于这样的载体上的探针的量。这种或其他形式的合适的测定方法可见于例如WO89/03891和WO90/13667中。
测序核苷酸(例如所述ZNF145核酸)的测试包括：将包含靶DNA或RNA的生物样本与包含多核苷酸或引物的探针在进行杂交的条件下接触，并通过例如Sanger双脱氧链终止法确定所述序列(参见Sambrook et al.)。
这样的方法一般包括：在合适试剂存在的情况下通过合成与靶DNA或RNA互补的链来延伸所述引物，并且在一个或多个A、C、G或T/U残基处选择性终止延伸反应；使得发生链延伸和终止反应；根据大小分离出所述延伸产物以确定选择性终止发生处的核苷酸序列。合适的试剂包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP、缓冲液和ATP。双脱氧核苷酸被用于选择性终止。
ZNF145控制区域
为了一些目的，可能有必要使用或研究ZNF145的控制区域。这样的控制区域包括启动子、增强子和基因座控制区。对于控制区域，本发明人是指能够调节与其有效连接的编码序列的表达的核酸序列或结构。
例如，控制区域可用于产生表达ZNF145的转基因动物。此外，控制区域可被用于产生ZNF145的表达载体。这将在下文中进一步详述。
鉴定ZNF145的控制区域是容易的，并且可通过多种方式进行。例如，ZNF145的编码序列可通过使用人或小鼠ZNF145cDNA序列作为探针筛选cDNA文库而从生物中得到。5’序列可通过筛选适当的基因组文库或者通过本领域中已知的引物延伸得到。还可以利用对基因组数据库进行数据库搜索。特别关注的这类5’序列包括非编码区域。所述5’区域可由肉眼检查，或者借助计算机程序检查，以鉴定表明启动子和/或增强子区域存在的序列基序。
此外，可对来自两种或多种生物的ZNF145核酸进行序列比对。通过比对来自不同物种的ZNF145序列，可能确定在不同物种间哪些氨基酸序列区域是保守的。这样的保守区域可能包含目的基因(即ZNF145)的控制区域。本文公开的小鼠和人基因组序列，例如小鼠ZNF145基因组序列，可用于此目的。此外，来自其他生物的ZNF145同源物可通过使用标准筛选方法使用产生自小鼠和人ZNF145序列的合适探针来得到。还可以筛选河豚(Takifugu rubripes)或斑马鱼的基因组，以鉴定ZNF145同源物；因此，一些斑马鱼ZNF145序列已被鉴定(上文所述)。对河豚或斑马鱼ZNF145基因的5’非编码区与小鼠或人基因组ZNF145序列之间的比较可用于鉴定包含控制区域的保守区域。
还可进行缺失研究以鉴定ZNF145的启动子和/或增强子区域。
推定控制区域的种类可通过分子生物学实验确认，在所述分子生物学实验中将候选序列与报告基因连接并检测所述报告基因的表达。
ZNF145过表达细胞
在一些方面，本文描述的方法和组合物使用过表达ZNF145的细胞，也就是说，ZNF145表达或活性上调的细胞。这样的细胞可包括软骨形成祖细胞，如间充质干细胞。它或它的祖先细胞可被工程改造以具有这样的性质。
一般而言，可通过将ZNF145表达载体(如下文所述)转染或引入合适的宿主细胞(例如软骨形成组干细胞如间充质干细胞)来构建ZNF145过表达细胞。
过表达ZNF145的细胞可显示出增加的软骨形成标记物表达。所述软骨形成标记物可包括本领域中已知的任何软骨发生标记物。例如，所述软骨形成标记物可包括2型胶原(COL2A1)。这样的标记物可由本领域中已知的方法检测，例如使用抗体和组织学染色、蛋白质印迹等。可检测两种2型胶原变体，即Col2A1变体1(GenBank编号NM_001844)和Col2A1变体2(GenBank编号NM_033150)。类似地，还可检测两种聚集蛋白聚糖变体，即聚集蛋白聚糖变体1(GenBank编号NM_001135)和聚集蛋白聚糖变体2(GenBank编号NM_013227)。Col10A1(GenBank编号NM_000493)和Sox9(GenBank编号NM_000346)也可被作为软骨形成标记物通过本领域中已知的方法检测。
过表达ZNF145的细胞可表现出增加的软骨、骨或韧带蛋白聚糖分泌。这样增加的分泌可通过本领域中已知的方法检测，例如通过阿辛蓝染色检测。它可表现出增加的修复软骨、骨或韧带缺陷的能力。这可通过细胞形态学；基质着色；表面规则性；软骨、硬骨或韧带的厚度；以及供体和宿主相邻软骨的整合中一种或多种的组织学分级来检测。Wakitani et al(1994)描述的组织学分级可用于这样的测定中。
可以将所述ZNF145过表达细胞培养成细胞系。所述ZNF145过表达细胞可通过本领域中已知的方式加以无限增殖化，例如通过在实施例中所详述的表达端粒酶。
为了上调ZNF145的表达，可将ZNF145多核苷酸序列与调节序列相连以使得所述调节序列指导ZNF145多核苷酸的表达。然后，可以使得在合适的靶细胞(例如间充质干细胞)中在所述调节序列控制下表达所述多肽。
所述调节序列可以是在天然条件下ZNF145多核苷酸与其不是相连的调节序列。
本发明人描述了一种表达ZNF145多肽的方法，所述方法包括提供细胞，如间充质干细胞，在所述细胞中已经使ZNF145多核苷酸与调节序列相连以使得所述调节序列指导所述多核苷酸的表达，并且在能使所述多肽表达的条件下培养所述细胞。
本发明人还描述了一种产生多肽的方法，所述方法包括：(a)提供通过如下方式产生的表达序列：将ZNF145多核苷酸序列与调节序列相连以使所述调节序列指导所述多核苷酸的表达；并且(b)使来自所述表达序列的多肽在所述调节序列的控制下表达。
具体而言，可以将编码所述各个ZNF145核酸或其同源物、变体或衍生物的ZNF145核苷酸序列插入到合适的表达载体中，即包含用于转录和翻译所述插入编码序列的必需元件的载体。
本发明人还提供了一种由任何以上所述方法产生的多肽。
能使ZNF145多肽表达的方法将在下文描述。应理解，这些方法可适用于本文描述的方法和组合物的实施方案中，在所述实施方案中需要上调多肽，例如上调ZNF145以实现间充质干细胞的软骨发生增加。
提供表达的多肽的一种方法是通过表达载体，即包含与编码目的多肽(如ZNF145)的序列有效连接的可调节启动子(任选地与其他调节序列如增强子一起)的载体(例如质粒)，所述编码目的多肽的序列已被克隆在所述表达载体中。这将在下文中进一步详述。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建包含编码ZNF145的序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括：体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。这样的技术在Sambrook，J.et al.(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ch.4，8，and16-17，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)和Ausubel，F.M.etal.(1995and periodic supplements；Current Protocols in MolecularBiology，ch.9，13，and 16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)中有描述。
多种表达载体/宿主系统可用于容纳和表达编码ZNF145的序列。它们包括但不局限于微生物，例如以重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；以酵母表达载体转化的酵母；以病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))或者以细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。可使用任何合适的宿主细胞。哺乳动物表达将在下文进一步详述。
“控制元件”或“调节序列”是与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译的载体的非翻译区(即增强子、启动子以及5’和3’非翻译区)。这类元件的强度和特异性可以不同。依赖于所使用的载体系统和宿主，可使用任意数量的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。这些将在下文进一步详述。
可使过表达ZNF145的细胞倾向于软骨形成分化。这可通过本领域中已知的多种方法实现，例如通过如Liu etal.，2007描述的团块培养系统。在该参考文献中描述的方法包括使软骨形成祖细胞(例如间充质干细胞)形成团块，并且在包含10ng/ml转化因子(TGF)-β3、10-7M地塞米松、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、40μg/ml脯氨酸、100μg/ml丙酮酸盐和50mg/ml ITS+Premix(Becton Dickinson、6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、1.25mg/ml BSA和5.35mg/ml亚油酸)的软骨形成培养基中培养。使细胞倾向于软骨形成分化的其他方法是本领域中已知的，并且可用在本文描述的方法和组合物中。
除了在所述细胞中过表达ZNF145，可控制其他蛋白质的表达以提高或增强软骨发生。例如，可将所述细胞(或其祖先细胞)工程改造以增加以下任一种或多种物质的表达或活性：Nanog、Oct4、端粒酶、SV40大T抗原、HPV E6、HPV E7和Bmi-1。
ZNF145表达载体
为了在间充质干细胞中进行ZNF145操作和过表达，可将ZNF145多核苷酸整合至重组的可复制载体中。所述载体可用于在相容性宿主细胞中复制所述核酸。
本发明人提供了一种通过如下方式制备多核苷酸的方法，将多核苷酸引入可复制载体，将所述载体引入相容性宿主细胞并且在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。所述载体可从所述宿主细胞中回收。合适的宿主细胞包括细菌例如大肠杆菌(E.coli)、酵母、哺乳动物细胞系和其他真核细胞系例如昆虫Sf9细胞。
还可将ZNF145多核苷酸整合至表达载体中，用于在间充质干细胞中表达ZNF145。例如，载体中的ZNF145多核苷酸可与控制序列有效地连接，所述控制序列能够用于供给所述编码序列通过所述宿主细胞的表达，即所述载体是表达载体。术语“有效地连接”是指所描述的组分处于能使它们以其预定的方式发挥功能的关系。“有效地连接”至编码序列的调节序列或调节区域的连接方式是使得所述编码序列的表达在与所述控制序列相容的条件下实现。
调节区域
在一个优选实施方案中，ZNF145通过与间充质干细胞表达的基因的调节区域有效地连接而在间充质干细胞中表达。
真核细胞中控制蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子是由多种遗传元件组成的。所述细胞机制能够收集并整合由每个元件传递的调节信息，使得不同的基因进化出通常是复杂的不同转录调节形式。
这里使用的控制序列可被修改，例如通过加入其他转录调节元件，以使由所述控制序列指导的转录水平对转录调节物的更敏感。
本文使用的术语启动子是指聚集在RNA聚合酶II起始位点周围的一组转录控制模块。关于启动子是如何组织的许多见解来自于对一些病毒启动子的分析，所述病毒启动子包括用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的启动子。这些研究(被近来更多的研究扩充)已经证明启动子是由离散功能模块组成的，所述功能模块每个均是由大约7-20bp的DNA组成，并且包含一个或多个转录激活蛋白的识别位点。
每个启动子中的至少一个模块的功能是指出RNA合成的起始位点。关于这个的最为人所知的实例是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的启动子中(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)覆盖在起始位点的离散元件本身帮助固定起始位置。
其他的启动元件调节转录起始的频率。一般而言，它们位于所述起始位点上游30-110bp的区域内，但很多启动子最近已被证明还包含位于所述起始位点下游的功能元件。元件之间的距离是可变的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时启动子的功能仍然保持。在所述tk启动子中，元件之间的距离可增加至相距50bp，之后活性开始下降。根据所述启动子的不同，似乎个体的元件可协作地或单独地激活转录。
增强子最初作为增强来自位于同一DNA分子较远位置处的启动子的转录的遗传元件而被检测到。这种能够跨越远距离起作用的能力在传统的原核转录调节研究中几乎没有先例。随后的工作证明带有增强子活性的DNA区域的组织与启动子十分相像。也就是说，它们由很多个体的元件组成，每个元件可结合一个或多个转录蛋白质。
增强子和启动子之间的本质区别在于可操作性。增强子区域作为整体必须能够刺激远距离处的转录；而这对于启动子区域或它的组成元件来说不必是一定的。在另一方面，启动子必须有一个或多个在特定位点和在特定方向上指导RNA合成起始的元件，而增强子缺乏这些特异性。除了这些可操作性区别，增强子和启动子是非常相似的实体。
启动子和增强子具有相同的激活细胞中转录的一般功能。它们经常是重叠或连续的，经常看起来有相似的模块组织。从整体来看，这些见解表明增强子和启动子是同源实体，并且与这些序列结合的转录激活蛋白可以基本相同的方式与细胞转录机制相互作用。因此，ZNF145表达载体除包含ZNF145编码蛋白外，还可包含启动子和/或增强子。
用ZNF145表达构建体病毒转化MSC
可将ZNF145载体例如ZNF145表达载体，如下文所述转化或转染至合适的宿主细胞例如间充质干细胞中，以进行ZNF145蛋白的表达。
a.腺病毒感染
一种为增加ZNF145表达而递送所述表达载体的方法包括使用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体整合进入基因组DNA的能力较低，但这个特点可被这些载体提供的高效基因转化所抵消。“腺病毒表达载体”意欲包括那些这样的构建体，即所述构建体包含腺病毒序列足以(a)支持所述构建体的包装以及(b)最终表达已被克隆至其中的转基因构建体。
所述载体包含遗传工程改造形式的腺病毒。关于所述遗传组织或腺病毒(一种36kb的、线性双链DNA病毒)的知识使得可用最多达7kb的外源序列置换大片的腺病毒DNA(Grunhaus and Horwitz，1992)。与逆转录病毒不同，所述腺病毒对宿主细胞的感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA能够以附加体的方式复制而无潜在基因毒性。同时，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增后没有检测到基因组重排。
腺病毒因其基因组大小适中、容易操作、高效价、广泛的靶细胞范围和高感染性而特别适合用作基因转移载体。所述病毒基因组的两个末端都包含100-200个碱基对的反向重复(ITR)，所述反向重复是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。所述基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含通过病毒DNA复制起始而分开的不同转录单元。所述E1区域(E1A和E1B)编码负责调节所述病毒基因组和一些细胞基因转录的蛋白质。E2区域(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。所述晚期基因的产物(包括大多数的病毒衣壳蛋白)仅在单一主要转录物大量产生之后才表达，所述单主要转录物是由主要晚期启动子(MLP)转录的。所述MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期尤其有用，并且这个启动子转录的所有mRNA都具有使它们成为适合用于翻译的mRNA的5’-三联前导(TPL)序列。
重组腺病毒可通过穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于两个原病毒载体之间的可能重组，野生型腺病毒可能从该过程中产生。因此，关键是从个体噬斑分离单个病毒克隆并且检查其基因组结构。
具有复制缺陷的现有腺病毒载体的产生和繁殖依赖于被命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系是以Ad5DNA片段从人胚肾细胞转化的并且组成地表达E1蛋白质(Graham et al.，1977)。由于所述E3区域是可从腺病毒基因组中省去(Jones and Shenk，1978)，所述现有腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1区、D3区或这两个区域内携带外源DNA((Graham and Prevec，1991)。天然情况下，腺病毒可包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury et al.，1987)，提供约2kb额外DNA的容量。结合在所述E1和E3区域中大约5.5kb的可替换的DNA，所述现有腺病毒载体的最大容量小于7.5kb，或是所述载体总长的约15％。超过80％的腺病毒基因组仍保持在所述载体主链中。
辅助细胞系可源自人细胞，如人胚肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或者其他人胚间充质或上皮细胞。或者，所述辅助细胞可来自其他可允许人腺病毒的哺乳动物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚间充质或上皮细胞。辅助细胞系的实例有293。
Racher等人(1995)公开了用于培养293细胞并增殖腺病毒的改良方法。在一种形式中，通过将个体的细胞接种至装有100-200ml培养基的1升硅化处理的转瓶(Techne，Cambridge，UK)中培养天然细胞集合体。在40rpm下搅拌后，用台盼蓝评估细胞生存力。在另一种形式中，按如下方式使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将悬浮于5ml培养基中的细胞接种物加入250ml锥形烧瓶中的载体(50ml)中，并静置(偶尔搅拌)1至4小时。然后，用50ml新鲜培养基替换所述培养基，并开始震荡。对于病毒产生，可使细胞生长至约80％汇合，在这之后替换所述培养基(至最终体积的25％)并且并以0.05的MOI加入腺病毒。将培养物静置过夜，之后将体积增加至100％，并开始震荡另外72小时。
除了需要所述腺病毒载体是复制缺陷型或至少是条件缺陷型之外，并不认为所述腺病毒载体的性质对用于增加ZNF145表达的表达构建体的成功转化和表达是关键的。所述腺病毒可以是42种已知的不同血清型或亚型A-F中任一种。亚型C的5型腺病毒可用作起始材料，以得到用于本文描述的方法和组合物的条件复制缺陷型腺病毒载体。这是由于5型腺病毒是大量生物化学和遗传学信息已知的人腺病毒，并且在历史上它曾被用于使用腺病毒作为载体的大多数构建中。
如上文所述，所述常规的载体是复制缺陷型，并且不应有腺病毒E1区域。因此，最方便的是将用于增加ZNF145表达的转化构建体在E1编码区去除的位置处引入。但是，用于增加ZNF145表达的表达构建体在所述腺病毒序列中的插入位置并不是关键的。还可将编码ZNF145的多核苷酸代替缺失的E3区域插入至如Karlsson等人(1986)所述的E3置换型载体中，或者插入至辅助细胞系或辅助病毒补偿所述E4缺陷的E4区域中。
腺病毒培养和操作是本领域技术人员已知的，并且显示出广泛的体外和体内宿主范围。这类病毒能够以很高效价得到，例如109-1011噬斑形成单位/ml，并且它们是高感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合进入宿主细胞基因组。由腺病毒载体递送的外源基因是附加体的，因此对宿主细胞具有低基因毒性。在用野生型腺病毒进行疫苗接种的研究中还没有副作用的报道(Couch et al.，1963；Top et al.，1971)，证明了它们作为体内基因转运载体的安全性和治疗潜力。
腺病毒载体已被用于真核基因表达(Levrero et al.，1991；Gomez-Foix et al.，1992)和疫苗开发(Grunhaus and Horwitz，1992；Graham and Prevec，1992)。最近，动物研究表明重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet et al.，1990；Rich et al.，1993)。对不同组织给予重组腺病毒的研究包括气管内滴注(Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992)、肌肉注射(Ragot et al.，1993)、外周静脉注射(Herz and Gerard，1993)和对脑的立体疫苗接种(Le Gal La Salle et al.，1993)。
b.AAV感染
腺伴随病毒(AAV)是可用于本文描述的方法和组合物中的吸引人的载体体系，原因是它具有高整合频率并且它能够感染非分裂细胞，因此使得它能够用于将基因递送至组织培养物中的哺乳细胞中(Muzyczka，1992)。AAV具有广泛的用于感染的宿主范围(Tratschin，et al.，1984；Laughlin，et al.，1986；Lebkowski，et al.，1988；McLaughlin，et al.，1988)，这意味着它适于使用。关于rAAV载体的产生和使用的细节在美国专利No.5,139,941和美国专利No.4,797,368中有描述，每篇专利都以引用的方式纳入本文。
证明AAV在基因递送中的用途的研究包括LaFace et al.(1988)；Zhou et al.(1993)；Flotte et al.(1993)和Walsh et al.(1994)。重组AAV载体已成功地用于体外和体内转导标记物基因(Kaplitt，et al.，1994；Lebkowski，et al.，1988；Samulski，et al.，1989；Shelling andSmith，1994；Yoder，et al.，1994；Zhou，et al.，1994；Hermonat andMuzyczka，1984；Tratschin，et al.，1985；McLaughlin，et al.，1988)和涉及人疾病的基因(Flotte，et al.，1992；Luo，et al.，1994；Ohi，et al.，1990；Walsh，et al.，1994；Wei，et al.，1994)。最近，AAV载体已经被批准用于治疗囊性纤维化的I期人试验。
AAV是依赖性细小病毒，因为它需要与其他病毒(腺病毒或疱疹病毒家族成员)共感染以在所培养的细胞中发生生产性感染(Muzyczka，1992)。在不与辅助病毒共感染的情况下，所述野生型AAV基因组通过其末端整合至人19号染色体，它在其上作为原病毒以潜伏的状态存在(Kotin et al.，1990；Samulski et al.，1991)。但是，rAAV并不限于整合在19号染色体上，除非AAV Rep蛋白也被表达(Shelling and Smith，1994)。当带有AAV原病毒的细胞被辅助病毒重叠感染时，所述AAV基因组被从所述染色体中或从重组质粒中“拯救”出来，并且建立正常的生产性感染(Samulski，et al.，1989；McLaughlin，et al.，1988；Kotin，et al.，1990；Muzyczka，1992)。
一般而言，重组AAV(rAAV)病毒是通过共转染包含目的基因(例如以两个末端重复序列为侧翼的ZNF145)的质粒(McLaughlin et al.，1988；Samulski et al.，1989；每篇均通过引用的方式纳入本文)和包含无末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒例如pIM45(McCarty et al.，1991；通过引用的方式纳入本文)。所述细胞还被腺病毒或携带有AAV辅助功能所需的腺病毒基因的质粒感染或转染。以此方式制备的rAAV病毒储液被腺病毒污染，必须将所述腺病毒从rAAV颗粒中通过物理方式分离出来(例如，通过氯化铯密度离心)。或者，可使用包含所述AAV编码区域的腺病毒载体或包含所述AAV编码区域以及一些或全部所述腺病毒辅助基因的细胞系(Yang et al.，1994a；Clark et al.，1995)。还可使用携带有作为整合的原病毒的所述rAAV DNA的细胞系(Flotte et al.，1995)。
c.逆转录病毒感染
所述逆转录病毒是一类单链RNA病毒，特征是能够在感染细胞中通过逆转录过程将它们的RNA转化为双链DNA(Coffin，1990)。然后，所得到的DNA作为原病毒稳定地整合进入细胞染色体并且指导病毒蛋白的合成。所述整合可导致所述病毒基因序列在受体细胞及其后代中的保留。所述逆转录基因组包含3个基因：gag、pol和env，分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。出现于gag基因上游的序列包含将所述基因组包装进入病毒体的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于所述病毒基因组的5’和3’末端。它们包含强启动子和增强子序列，并且也是整合至所述宿主基因组所需要的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录载体，将编码目的转基因(例如ZNF145)的核酸代替一些病毒序列插入所述病毒基因组，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建包含所述gag、pol和env基因但没有所述LTR和包装组分的包装细胞系(Mann et al.，1983)。当包含cDNA以及所述逆转录LTR和包转序列的重组质粒被引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉积)，所述包装序列可使所述重组质粒的RNA转录物被包装成病毒颗粒，所述病毒颗粒然后被分泌至培养基中(Nicolas andRubenstein，1988；Temin，1986；Mann et al.，1983)。然后，收集包含所述重组逆转录病毒的培养基，任选将其浓缩并用于基因转运。逆转录病毒能够感染多种细胞类型。但是，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.，1975)。
使用缺陷逆转录病毒载体的担心是在所包装的细胞中可能出现野生型可复制病毒。这可由重组事件引起，在所述重组事件中来自所述重组病毒的完整序列插入整合至所述宿主细胞基因组中的gag、pol和env序列的上游。但是，现在可获得的新包装细胞系应大幅度地降低了重组的可能性(Markowitz et al.，1988；Hersdorffer et al.，1990)。
d.慢病毒
基于1型人免疫缺陷病毒(HIV)(HIV-1)的慢病毒载体形成了基因治疗领域的最近进展。HIV-1衍生的载体的关键特性是它们能够感染非分裂细胞。已产生了高效价HIV-1衍生的载体。慢病毒载体的实例包括White等人(1999)描述的基于HIV、猴免疫缺损病毒(SIV)和水泡性口炎病毒(VSV)的慢病毒载体，发明人将其称为HIV/SIVpack/G。该载体体系的致病性的可能性很小。用无限增殖化的人淋巴细胞、人原代巨噬细胞、人骨髓来源的CD34(+)细胞和原代小鼠神经元证明了HIV/SIVpack/G的转导能力。Gasmi等人(1999)描述了一种体系，以通过使用在巨细胞病毒介导的早期启动子控制下编码HIV-1的gag、pol和tat的表达质粒短暂地产生基于HIV-1的载体。
e.其他病毒载体
其他病毒载体也可用作构建体。可使用来自病毒的载体，所述病毒如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar etal.，1988)和疱疹病毒。它们为多种哺乳动物细胞提供一些有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal and Sugden，1986；Coupar et al.，1988；Horwich et al.，1990)。
由于最近识别了缺陷型乙型肝炎，得到了关于不同病毒序列结构-功能关系的新见解。体外研究表明所述病毒即使缺失最多达其基因组的80％仍可保持辅助依赖型包装和逆转录的能力(Horwich et al.，1990)。这表明大部分的基因组都可被外源基因材料替换。Chang等人最近将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因代替聚合酶、表面和前表面(pre-surface)编码序列引入至鸭乙型肝炎病毒基因组中。将它与野生型病毒共转染至禽肝癌细胞系中。将含有高效价所述重组病毒的培养基用于感染原代幼鸭肝细胞。稳定的CAT基因表达在转染后至少24天被检测到(Chang et al.，1991)。
还可将待递送的核酸(例如ZNF145表达构建体)置于已被工程改造以表达特异性结合配体的感染性病毒中。因此，所述病毒颗粒可与所述靶细胞的相关受体特异性结合并且将所述内容物递送至所述细胞。最近基于对逆转录病毒的化学修饰开发了设计用于允许特异性靶向逆转录载体的新方法，所述化学修饰是通过化学方法将乳糖残基添加至所述病毒包膜上进行的。这种修饰使得可通过唾液酸糖蛋白受体来特异性感染肝细胞。
靶向重组逆转录病毒的另一方法被设计为其中使用抗逆转录病毒包膜蛋白的和抗具体细胞受体的生物素化抗体。可通过使用链亲和素经由生物素组分将所述抗体偶联(Roux et al.，1989)。使用抗I类和II主要组织相容性复合体抗原的抗体，它们证明了同向性病毒在体外对多种带有这些表面抗原的人细胞的感染(Roux et al.，1989)。
f非病毒转运
通常将DNA构建体(例如本文描述的表达载体)递送至细胞，在一些情况下，待转运的核酸是非感染性的，可使用非病毒方法转运。
可使用一些用于将表达构建体转运至所培养的哺乳动物细胞的非病毒方法。这些方法包括磷酸钙沉淀法(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖法(Gopal，1985)、电穿孔法(Tur-Kaspa et al.，1986；Potter et al.，1984)、直接显微注射法(Harland and Weintraub，1985)、装载DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley et al.，1979)、细胞超声处理(Fechheimer et al.，1987)、使用高速微粒进行基因轰击(Yang et al.，1990)和受体介导的转染(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。
一旦所述构建体被递送至所述细胞，编码ZNF145的核酸可位于不同位置并在不同位置表达。所述核酸ZNF145可被稳定地整合进入所述细胞的基因组中。该整合可以是经由同源重组的在同源的位置和方向上(基因替换)或者它可被整合在随机非特异性位置(基因增强)。所述核酸可能会以单独的附加体DNA片段形式稳定地存在于所述细胞中。这样的核酸片段或“附加体”可编码足以使得可独立于所述宿主细胞周期或者与其同步维持和复制的序列。所述表达构建体如何被递送至细胞以及所述核酸存留在细胞何处仍然取决于所使用的表达构建体的类型。
例如，可以将所述表达构建体装入脂质体。脂质体是特征为磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多层脂质层。它们是在将磷脂悬浮于过量水性溶液时自发形成。所述脂质组分进行自我重排，然后形成闭合结构，并且在脂质双层之间纳入水和溶解的溶质(Ghosh and Bachhawat，1991)。将DNA加入阳离子脂质体可引起从脂质体拓扑转变成光学上双折射的液体-结晶性浓缩球状物(Radler et al.，1997)。这些DNA-脂质复合物是用于基因治疗的潜在非病毒载体。
脂质体介导的外源DNA体外核酸递送和表达非常成功。使用β-内酰胺酶基因，Wong等人(1980)证明了在所培养的鸡胚、HeLa细胞和肝癌细胞脂质体介导的外源DNA递送和表达的可行性。Nicolau等人(1987)在大鼠中成功完成了在静脉注射后的脂质体介导的基因转运。还包括多种涉及“脂质转染”技术的商业化方法。
所述脂质体可与血凝病毒(HVJ)复合。这已被证明可有利于与细胞膜的融合并促进脂质体包囊的DNA进入细胞(Kaneda et al.，1989)。所述脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合，或者与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)联合使用(Kato et al.，1991)。所述脂质体可与HVJ和JMG-1复合，或者与HVJ和JMG-1联合使用。这样的表达构建体已被成功地用于体外和体内核酸转运和表达。
可用于向细胞递送编码治疗基因的核酸的其他载体递送系统包括受体介导的递送载体。这些利用了在几乎所有真核细胞中通过受体介导的内吞作用选择性摄取大分子。由于多种受体的细胞类型特异性分布，所述递送可以是高度特异性的(Wu and Wu，1993)。
受体介导的基因靶向载体一般由两个组分构成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。一些配体已被用于受体介导的基因转运。最广泛表征的配体是脱唾液酸血清类黏蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)(Wu and Wu，1987)和transferring(Wagner et al.，1990)。最近，可识别与ASOR相同的受体的合成新糖蛋白已被用作基因递送载体(Ferkol et al.，1993；Perales et al.，1994)，并且表皮生长因子(EGF)也已被用于递送基因至鳞癌细胞(Myers，EPO 0 273 085)。
所述递送载体可包含配体和脂质体。例如，Nicolau等人(1987)使用了纳入脂质体的乳糖基神经酰胺--一种具有半乳糖末端的脱唾液酸神经节苷脂(asialganglioside)，并且观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。因此，还可将编码治疗性基因的核酸通过任意数目的带有或不带有脂质体的受体-配体系统特异性地递送至细胞类型，如间充质干细胞。
所述表达载体可仅由裸露的重组DNA或质粒构成。所述构建体的转运可通过以任何上述的方法进行，所述方法可通过物理或化学方式透化细胞膜。这尤其适用于体外转运，但是，它也适用于体内用途。Dubensky等人(1984)成功地将CaPO4沉淀物形式的多瘤病毒DNA注射进入成体和新生小鼠的肝脏和脾脏中，证明了活性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明了直接腹膜内注射CaPO.sub.4沉淀的质粒可导致所述转染基因的表达。可以想到的是，编码CAM的DNA也可能会以类似的方式在体内转运并且表达CAM。
转运裸露的DNA表达构建体至细胞的另一实施方案可涉及粒子轰击。该方法依赖于以下能力：将DNA包被的微粒加速至可使其刺穿细胞膜并且进入细胞而不杀死它们的高速(Klein et al.，1987)。已经开发了加速小颗粒的多种装置。一个这样的装置依赖于高压放电以产生电流，所述电流又提供原动力(Yang et al.，1990)。所使用的微粒是由生物惰性物质例如钨或金珠构成的。
ZNF145的表达
在哺乳动物宿主细胞中，可使用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将编码ZNF145的序列连接至腺病毒转录/翻译复合体，所述复合体由晚期启动子和三联前导序列组成。在所述病毒基因组的非必需E1和E3区域中的插入物可用于得到能够在感染的宿主细胞中表达ZNF145的活病毒(Logan，J.and T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。此外，转录增强子例如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
因此，例如，所述ZNF145蛋白可在人胚肾293(HEK293)细胞或粘附的dhfr CHO细胞中表达。为了最大化受体表达，一般将全部5’和3’非翻译区(UTR)从所述受体cDNA上除去，然后插入pCDN或pCDNA3载体中。用个体受体cDNA通过脂质转染来转染所述细胞，并且在存在400mg/ml G418情况下进行选择。在选择3周后，挑出个体克隆并扩增用于进一步的分析。将仅转染了载体的HEK293或CHO细胞用作阴性对照。为了分离稳定表达所述个体受体的细胞系，一般选择约24个克隆并且通过RNA印迹进行分析。受体mRNA通常可在约50％的所分析的G418抗性克隆中检测到。
再例如，可将ZNF145通过慢病毒载体系统引入细胞例如间充质干细胞中。因此，ZNF145序列可从例如合适的来源得到，例如来自进行骨发生的MSC的cDNA，并且可被克隆至合适的载体例如pEntry3C(Invitrogen)中。用于过表达ZNF145的慢病毒载体(即慢病毒ZNF145表达载体)可经重组产生，例如通过该载体与pLenti6/V5(Invitrogen)之间的LR重组。慢病毒可通过将所述慢病毒ZNF145表达载体和合适的包装混合物(例如，来自Invitrogen)共转染至合适的宿主细胞例如293FT细胞中生成。将包含慢病毒表达载体的病毒上清液用于感染所选择的宿主细胞，例如间充质干细胞。感染的细胞用例如5μg/ml的杀稻瘟素选择7天。
人人工染色体(HAG)也可用于递送比质粒所能包含和表达的DNA片段更大的DNA片段。构建约6kb至10Mb的HAC并通过常规递送方法(脂质体、聚阳离子氨基聚合物或载体)递送以用于治疗目的。
还可使用特异性起始信号来实现对编码ZNF145的序列的更有效翻译。这样的信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在编码ZNF145的序列及其起始密码子和上游序列被插入至合适表达载体中的情况下，可不需要另外的转录或翻译控制信号。但是，在仅编码序列或其片段被插入的情况下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，所述起始密码子应在正确的阅读框内以确保对整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是多种来源的，天然的和合成的。表达的效率可通过纳入适用于所使用的具体细胞系统的增强子来提高，所述增强子例如文献描述的那些(Scharf，D.et al.(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-162)。
此外，可选择这样的宿主细胞株系，即它有调节所述插入序列表达的能力或以所需方式加工所表达的蛋白质的能力。所述多肽的这类修饰包括但不局限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。切断“前蛋白(prepro)”形式的所述蛋白质的翻译后加工也可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。具有特定细胞机器和特征性翻译后活性机制的不同宿主细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)可得自美国模式培养物保藏所(ATCC，Bethesda，Md.)，并且可被选择以确保对所述外源蛋白质的正确修饰和加工。
为了长期地且高产率地产生重组蛋白质，可使用稳定表达。例如，可使用表达载体转化能够稳定表达ZNF145的细胞系，其中所述表达载体可包含病毒复制起点和/或内源表达元件以及在相同或不同载体上的选择性标记物。引入所述载体之后，可使细胞在富集培养基中生长约1至2天，然后换成选择培养基。所述选择性标记物的目的是赋予对选择的抗性，并且它的存在使得可以培养和回收成功表达所述引入序列的细胞。稳定转化细胞的抗性克隆可使用适用于所述细胞类型的组织培养技术来增殖。
可使用任意数目的选择系统来回收转化的细胞系。这些包括但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler，M.et al.(1977)Cell11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Lowy，I.et al.(1980)Cell22：817-23)，它们分别可被用在tk-或apr-细胞中。同样，可以将抗代谢物、抗生素或除草剂抗性物用作选择的基础。例如，dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler，M.et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt赋予对氨基糖苷类新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F. et al(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)；als或pat分别赋予对绿黄隆(chlorsulfuron )和草铵膦乙酰转移酶(phosphinotricin acetyltransferase)的抗性(Murry，见上文)。其他的选择性基因已有描述，例如trpB，它可使细胞使用吲哚代替色氨酸；或者hisD，它可使细胞使用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：8047-51)。最近，可视标记物的使用已经日渐普遍，这样的标记物如花青素、β-葡萄糖苷酸酶及其底物GUS，以及荧光素酶及其底物荧光素。这些标记物不仅可用于鉴定转化株，而且还可以定量可归因于具体载体系统的瞬时或稳定蛋白表达的量(Rhodes，C.A.et al.(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131)。
尽管标记基因表达的存在/不存在表明目的基因也存在，但可能需要确认所述基因的存在和表达。例如，如果所述编码ZNF145的序列被插入到标记基因序列内，包含编码ZNF145的序列的转化细胞可通过不存在标记基因功能而被鉴定。或者，标记基因可被置于与编码ZNF145的序列串联并且处于单个启动子的控制下。所述标记基因响应于诱导或选择的表达一般表明所述串联的基因也表达。
或者，包含编码ZNF145的核酸序列并且表达ZNF145的宿主细胞可通过本领域技术人员已知的多种方法鉴定。这些方法包括但不局限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或者免疫测定技术，所述免疫测定技术包括用于检测和/或定量核酸或蛋白序列的基于膜、溶液或芯片的技术。
编码ZNF145的多核苷酸序列的存在可通过使用探针或片段或编码ZNF145的多核苷酸的片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。基于核酸扩增的测定包括使用基于编码ZNF145的序列的寡核苷酸或寡聚体，以检测包含编码ZNF145的DNA或RNA的转化株。
本领域已知用于检测并测量ZNF145表达的多种方法，所述方法使用对所述蛋白质特异性的多克隆或单克隆抗体。这样的技术的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。可使用基于双位点、单克隆的免疫测定，所述免疫测试利用对ZNF145上两个互不干扰的表位产生反应的单克隆抗体，但是也可以使用竞争性结合测定。这些测定或其他测定在本领域中，例如在Hampton，R.et al.(1990；Serological Methods，aLaboratory Manual，Section IV， APS Press，St Paul，Minn.)和在Maddox，D.E.et al.(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)中，已有详尽描述。
多种标记物和缀合技术为本领域技术人员所知并且可被用于多种核酸和氨基酸测定中。产生用于检测与编码ZNF145的多核苷酸相关的序列的经标记杂交或PCR探针的方法包括寡核苷酸标记、切口移位、末端标记或使用经标记核苷酸的PCR扩增。或者，可将编码ZNF145的序列或其任意片段克隆至载体，用于产生mRNA探针。这样的载体是本领域中已知的，是市售的，并且可用于通过加入合适的RNA聚合酶如T7、T3或SP6以及经标记的核苷酸来在体外合成RNA探针。可用多种市售试剂盒来进行这些方法，所述试剂盒例如由Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo，Mich.)、Promega(Madison，Wis.)和U.S.Biochemical Corp.(Cleveland，Ohio)提供的那些试剂盒。可用于使检测容易的合适报告分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光物、化学发光物或生色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
可将用编码ZNF145的核苷酸序列转化的宿主细胞在适于从细胞培养物中表达和回收所述蛋白质的条件下培养。由经转化的细胞产生的蛋白质根据所使用的序列和/或载体可位于细胞膜中、被分泌或者包含在细胞内。如本领域技术人员所理解的，可将包含编码ZNF145的多核苷酸的表达载体设计为包含指导ZNF145分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。其他构建体可用于将编码ZNF145的序列与编码有利于溶解蛋白质纯化的多肽结构域的序列连接。这类有利于纯化的结构域包括但不局限于金属螯合肽例如使得可在经固定的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块；使得可在经固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)中使用的结构域。在纯化结构域和所述ZNF145编码区域之间纳入可切割连接序列(例如对XA因子或肠激酶特异性的可切割连接序列(Invitrogen，San Diego，Calif))可用于帮助纯化。一个这样的表达载体可供表达包含ZNF145和在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点之前编码6个组氨酸残基的核酸的融合蛋白。所述组氨酸残基可有利于在固定金属离子亲和色谱(IMIAC，在Porath，J.et al.(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281中描述)进行纯化，而所述肠激酶切割位点提供一种从所述融合蛋白中纯化ZNF145的方法。关于包含融合蛋白的载体的详述在Kroll，D.J.et al.(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)中提供。
ZNF145的片段以及全长多肽，不仅可通过重组生产来产生，而且可通过使用固相技术的肽直接合成产生(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。蛋白质合成可通过手工技术或者自动技术进行。自动合成可通过例如使用Applied Biosystems 431A肽合成器(Perkin Elmer)完成。ZNF145的多种片段可分别合成，然后将其结合以产生全长分子。
还已知其他表达方法，例如被称作“基因活化”的方法可用于调节ZNF145的活性或表达。该方法在美国专利5,641,670中有详细描述，所述专利以引用的方式纳入本文。在本质上，基因活化方法是基于这样的认识，即细胞内目的内源基因的调节和活性可通过同源重组在预选位点向所述细胞基因组内插入合适的DNA构建体来改变，所述合适的DNA构建体包括：(a)靶向序列；(b)调节序列；(c)外显子和(d)不成对的剪接供体位点，其中所述靶向序列指导元件(a)-(d)的整合以使得所述元件(b)-(d)可有效地连接至所述内源基因。或者，所述DNA构建体可包括：(a)靶向序列；(b)调节序列；(c)外显子；(d)剪接供体位点；(e)内含子和(f)剪接受体位点，其中所述靶向序列指导元件(a)-(f)的整合以使得所述元件(b)-(f)可有效地连接至所述内源基因的第一外显子。
所使用的靶向序列可参考所述DNA插入的位点选择。在两种排列中，所述靶向事件都用于形成新转录单元，所述新转录单元是由所述靶向DNA构建体引入的序列和内源细胞基因的融合产物。例如，所述新转录单元的形成使得可通过向宿主细胞引入DNA构建体活化而在宿主细胞中活化转录沉默基因(在转染前不在细胞中表达的基因)。内源基因(例如在如此获得的细胞中表达的ZNF145)的表达是可改变的，因为它是可增加的、减少的包括消除的，或者所述调节或诱导方式可通过使用基因活化方法改变。
ZNF145激动剂
鉴定ZNF145调节剂、激动剂和拮抗剂
可使用激动剂特别是小分子，以特异性增强用作软骨发生促进剂的ZNF145的活性或表达。
因此，本发明人公开了ZNF145激动剂(其可以是小分子)以及用于筛选这些激动剂的测定法。可通过检测对结合或其他ZNF145活性的调节如上调筛选ZNF145的激动剂。因此，本发明人提供了一种能够上调ZNF145多肽的表达、量和活性的化合物。这样的化合物可用于本文所述的方法和组合物中，用于促进软骨发生；软骨、骨或韧带修复、再生；治疗退行性疾病等。
因此，ZNF145可用于评估小分子底物与配体在例如细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构或功能模拟物。参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(1991)。此外，可进行筛选以鉴定影响ZNF145表达的因子，尤其是在软骨形成祖干细胞例如间充质干细胞中。
一般而言，对于激动剂的测定法依赖于确定候选分子对一种或多种ZNF145活性的作用。测定法可包括在候选分子存在的情况下测定ZNF145活性，任选在候选分子不存在的情况下测定ZNF145活性，或者在已知可抑制或活化ZNF145活性的分子存在的情况下测定ZNF145活性。
本发明人已证明，软骨形成间充质干细胞中ZNF145的表达增加；因此，对ZNF145表达的控制可用于促进软骨发生。因此，想要发现刺激ZNF145的表达和/或活性，或者可抑制该蛋白质的功能的化合物和药物。一般而言，激动剂和拮抗剂可用于针对任何已知退行性疾病的治疗和预防目的。
对于术语“上调”，本发明人包括对所研究的行为的任何积极作用；这可以是完全的或部分的。因此，当检测结合时，候选激动剂能够增强、促进两个实体之间的结合或使其更强。与无所述候选分子存在的情况下的结合(或任何活性)相比，由所述候选分子实现的对结合(或任何其他活性)的上调可以是至少10％，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更多。因此，适合用作激动剂的候选分子是能够增加所述结合或其他活性10％的分子。
术语“化合物”是指化学化合物(天然存在或合成的)，例如生物大分子(例如核酸、蛋白质、非肽或有机分子)，或由生物材料(例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织)制备的提取物，或者甚至是无机元素或分子。所述化合物可以是抗体。
ZNF145的潜在拮抗剂的实例包括小分子、核苷酸和它们的同源物，包括嘌呤和嘌呤类似物、与ZNF145结合配偶物密切相关的寡核苷酸或蛋白质，例如ZNF145结合配偶物的片段、与ZNF145结合但不诱发反应从而阻止所述多肽活性的小分子等。
筛选试剂盒
可以将进行这样的筛选所必需的材料包装至筛选试剂盒中。
这样的筛选试剂盒可用于鉴定ZNF145多肽或化合物的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等，所述ZNF145多肽或化合物降低或增加ZNF145的产生。所述筛选试剂盒可包括：(a)ZNF145多肽；(b)表达ZNF145多肽的重组细胞；或(c)针对ZNF145多肽的抗体。
抗ZNF145的抗体是本领域中已知的并且可通过市售获得，例如来自Anogen，Mississauga，Ontario，Canada的兔抗人PML的多克隆抗体-a(目录No AI70002A)和兔抗人PML的多克隆抗体-b(AI70002B)。
所述筛选试剂盒可包括文库。所述筛选试剂盒可包括筛选所需的任意一种或多种成分，如下文所述。所述筛选试剂盒可任选包括使用说明书。
还可提供能够检测核酸水平的ZNF145表达的筛选试剂盒。这样的试剂盒可包括用于扩增ZNF145的引物，或用于扩增的引物对。所述引物可选自任何合适的序列，例如所述ZNF145序列的一部分。鉴定引物序列的方法是本领域中熟知的，并且本领域技术人员能够容易地设计这样的引物。所述试剂盒可包括用于ZNF145表达的核酸探针，如本文所描述的。所述试剂盒还可任选地包括使用说明书。
合理的设计
可能能够与ZNF145相互作用的候选化合物的合理设计可基于对ZNF145多肽分子形状的结构研究。确定哪个位点与其他具体蛋白质相互作用的一种方法是物理结构测定，例如X射线晶体学或2维NMR技术。这些将提供关于哪个氨基酸残基形成分子接触区域的指导。关于蛋白结构确定的详细描述，参见例如Blundell and Johnson(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York。
多肽结合测定
ZNF145活性或表达的调节剂和拮抗剂可通过本领域中已知的任何方式鉴定。
所述测定以其最简单的形式可仅包括以下步骤：将候选化合物与含有ZNF145多肽的溶液混合以形成混合物，测量所述混合物中ZNF145多肽的活性，并且将所述混合物的活性与标准物比较。
此外，在检测ZNF145与假定分子之间的结合的测定法中，可通过分子对ZNF145的结合鉴定所述分子。
用于鉴定与本文描述的ZNF145多肽结合的物质的一种类型测定法包括将固定在固体载体上的ZNF145多肽与未固定的候选物质接触，确定目的ZNF145多肽是否与候选物质相互结合以及/或者结合的程度。或者，可将所述候选物质固定，并且本文所述的ZNF145多肽为非固定的。
所述物质对所述ZNF145多肽的结合可以是瞬时的、可逆的或永久的。所述物质可能会以比与对照多肽(例如已知不参与软骨发生的多肽)结合的Kd值更小的Kd值与所述多肽结合。所述物质的Kd值可以是与对照多肽结合的Kd值的2分之一，例如所述Kd值是与对照多肽结合的Kd值的100分之一或1000分之一。
在一个示例性测定方法中，所述ZNF145多肽可被固定于小珠例如琼脂糖珠上。这一般可以通过如下方式实现：在细菌、酵母或高等真核动物细胞系中将所述ZNF145多肽作为GST融合蛋白形式表达，并且使用谷胱甘肽-琼脂糖珠从细胞粗提取物中纯化所述GST-ZNF145融合蛋白(Smith and Johnson，1988；Gene 67(10)：31-40)。作为对照，不是GST-融合蛋白的候选融合蛋白与固定多肽的结合可在不存在所述ZNF145多肽的情况下确定。然后，可以确定所述候选物质与所述固定ZNF145多肽的结合。这种类型的测定法在本领域中以GST钓饵(pulldown)测定法为人所知。此外，可将所述候选物质固定，并且所述ZNF145多肽为非固定的。
还能够使用固定一种组分(例如Ni-NTA琼脂糖和组氨酸标记的组分)的不同亲和纯化系统来进行此类测定法。
所述多肽对所述候选物质的结合可通过本领域中公知的多种方法确定。例如，所述非固定的组分可以是经标记的(例如以放射性标记物、表位标签或酶-抗体缀合物标记)。或者，可通过免疫学检测技术确定结合。例如，可以对所述反应混合物进行蛋白质印迹，并且可以用检测所述未固定组分的抗体探测所述印迹。还可以使用ELISA技术。
一般将候选物质加入至终浓度为1至1000nmol/ml，例如1至100nmol/ml。对于抗体，所使用的终浓度一般为100至500μg/ml，例如200至300μg/ml。
通过检测ZNF145和与该多肽结合的任何分子之间结合的调节或者这样的结合或释放引起的任何对活性的调节，还可以鉴定ZNF145的调节剂和拮抗剂。
基于细胞的测定法
基于细胞的测定法可以仅测试候选化合物的结合，其中借助与所述候选化合物直接或间接相连的标记物，或者在包括使用经标记竞争剂的竞争的测定法中，可检测对带有所述ZNF145多肽的细胞的粘附。
此外，使用适于在其表面带有所述多肽的细胞的检测系统，这些测定法可测试所述候选化合物是否可导致因结合至所述ZNF145多肽而产生的信号。活化的抑制剂一般在存在已知激动剂的情况下测定，并且观察在所述候选化物存在的情况下激动剂对活化的作用。
筛选化合物的另一种方法利用了以表达化合物文库的重组DNA分子稳定转染的真核或原核宿主细胞。这样的细胞--活的或固定形式的--可用于标准的结合配偶物测定法中。还参见Parce et al.(1989)Science 246：243-247和Owicki et al.(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA87；4007-4011，它们描述了检测细胞反应的灵敏方法。
竞争性测定法尤其有用，其中将表达所述化合物文库的细胞与已知结合ZNF145多肽的经标记抗体(例如125I-抗体)和测试样本接触或用其孵育，所述测试样本例如其对所述结合组合物的结合亲和力待测量的候选化合物。然后，分离所述ZNF145多肽的结合的或游离的经标记结合配偶物，以评估结合的程度。所结合的测试样本的量和与所述ZNF145多肽结合的经标记抗体的量成反比。
多种技术中的任一种均可用于从游离的结合配偶物中分离结合物以评估结合的程度。该分离步骤一般可能包括以下步骤：例如粘附至过滤器之后洗涤，粘附至塑料之后洗涤或者离心细胞膜。
所述测定法可包括将候选分子暴露于细胞，例如软骨形成祖干细胞，例如间充质干细胞，并且通过任何合适的方法测定ZNF145的表达。可任选地选择在类测定法中上调ZNF145表达的分子用于进一步研究，以及用作上调ZNF145表达的药物。这样的药物可有效地用于治疗或预防退行性疾病，或者用于促进软骨、骨或韧带的修复或再生等等。
还可将编码ZNF145蛋白以及所述蛋白质的抗体的cDNA用于设计这样的测定法，所述测定法用于检测所加入的化合物对细胞中ZNF145mRNA和蛋白质生产的作用。例如，使用单克隆或多克隆抗体通过本领域中已知的标准方法，可构建ELISA来测量ZNF145多肽的分泌水平或细胞相关水平，这可以用于发现可抑制或增加经合适操作的细胞或组织中ZNF145蛋白生产的试剂(分别也称作拮抗剂或激动剂)。进行筛选测定法的标准方法是本领域中熟知的。
活性测定法
检测调节剂或拮抗剂的测定法一般包括在存在候选分子的情况下检测对任何ZNF145活性的调节，并且任选地在不存在候选分子的情况下检测对活性的调节。
可检测的活性可包括任何ZNF145依赖性活性，例如结合活性。已知ZNF145可结合UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)(Weidemann et al，FEBS Lett.2006 Dec11；580(28-29)：6649-54)，并且ZNF145对UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)的结合活性可通过本领域中已知的方法测定，例如GST-钓饵测定法。可将ZNF145和UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)之一固定，并将另一种放射标记。然后，通过测定将ZNF145暴露于UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)时所捕获的放射性，可检测ZNF145对UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)的结合。
还可使用可检测ZNF145的特定生物活性的测定法。所述测定法一般包括使候选分子(例如文库形式的)与ZNF145和候选调节剂接触，所述ZNF145为多肽形式、编码所述多肽的核酸形式或者包含这类物质的细胞、细胞器、提取物或其他材料形式。可检测ZNF145的相对活性(如下文所描述)，以确定所述候选调节剂的存在是否有任何作用。
可用于测定ZNF 134活性的任一种或多种已知ZNF145活性包括DNA结合、金属离子结合、蛋白质同型二聚化活性、特异性转录抑制物活性和锌离子结合。对于每种这些活性的测定法是本领域中公知的。ZNF145参与的过程包括凋亡、中枢神经系统发育、中肾发育、髓样细胞分化的负调节、转录的负调节、DNA依赖性、转录和泛素循环。测定这些过程的方法也是本领域中已知的。
上文描述的测定可在存在或不存在候选调节剂的情况下进行，并且检测所述合适活性以检测ZNF145活性的调节，因此鉴定ZNF145的候选调节剂和/或拮抗剂。
还可使用启动子结合测定法，来检测结合ZNF145并且/或者影响ZNF145的转录或表达的候选调节剂。然后，可选择候选调节剂用于进一步研究，或分离备用。这样的筛选方法的细节是本领域中公知的，并且在例如由Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编辑的Handbook of Drug Screening(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)中有描述。
本文描述的筛选方法可使用体内测定法，但可将它们设置为用于体外使用。体内测定法一般包括将包含ZNF145的细胞暴露于所述候选分子。在体外测定法中，将ZNF145在任选地存在其他组分的情况下暴露于所述候选分子，所述其他组分例如粗细胞提取物或半纯化的细胞提取物或经纯化的蛋白质。当进行体外测定法时，这些可使用候选分子的阵列(例如阵列的文库)。可使用体内测定法。因此，ZNF145多肽可包含在细胞内，例如异源性地包含在细胞内。这样的细胞可以是转基因细胞，所述转基因细胞已被如上所述进行工程改造以表达ZNF145。
当使用提取物时，它可包括细胞质提取物或核提取物，其制备方法是本领域中公知的。
应理解，可以使用包含ZNF145细胞的任意组分，如细胞器。一个实施方案使用细胞质或核制剂，例如包括包含所述ZNF145的细胞核。所述核制剂可包含一种或多种核，所述核可以是通过例如洗涤剂处理透化的或半透化的。
因此，在具体的实施方案中，测定形式可包括如下：准备多孔微量滴定板以在每个孔中容纳表达ZNF145多肽的一种或多种细胞；可将来自例如文库的各个候选分子或候选分子集合体(pool)加入到各个孔中并且测量对ZNF145活性的调节。当使用集合体时，可将它们亚分为更多的集合体并且用相同的方式加以测试。然后，可测定ZNF145活性，例如本文其他处描述的结合活性或转录共活化活性。
还可使用“减去”法替代上述测定方法或与上述测定方法一起鉴定ZNF145的调节剂或拮抗剂。在这样的“减去”法中，提供多种分子，所述分子包括一种或多种能够作为调节剂起作用的候选分子(例如，细胞提取物、核提取物、分子文库等)，并且从多种分子中除去、除尽或减去一种或多种组分。然后，通过暴露于包含所述ZNF145(或其组分)的细胞，测定所述“减去的”提取物等的活性。
因此，例如，可进行“免疫耗尽”测定法，以鉴定如下的调节剂。可从多能细胞(例如多能EG/ES细胞)制备细胞质或核提取物。所述提取物可被耗尽或者被分级以除去推定的调节剂，如通过使用合适抗体的免疫耗尽。如果所述提取物的调节剂被耗尽，它将失去影响ZNF145功能或活性或表达的能力。可能需要一系列的减去和/或耗尽来鉴定调节剂或拮抗剂。
还应理解，上述“耗尽”或“减去”测定法可用作预备步骤来鉴定推定的调节因子，用于进一步筛选。此外，或作为替代，所述“耗尽”或“减去”测定法可用于确认通过其他方法(例如，本文他处描述的“阳性”筛选)鉴定的分子作为推定调节剂的调节活性。
可以将经历所述测定法并且被发现值得关注的候选分子分离并进行进一步研究。目的分子的分离方法将依赖于所用的分子的类型，它是否是文库的形式，任意一次可测试多少候选分子，之后是否为分批步骤等。
所述候选分子可以文库的形式提供。在一个实施方案中，可同时筛选超过一种候选分子。通过本领域中已知方法，可生成候选分子文库，例如小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(例如组合文库)、反义分子(例如反义DNA或反义RNA)文库和抗体文库等。这样的文库适于高通量筛选。可将包含ZNF145的不同细胞暴露于所述文库的个体成员，并确定对ZNF145活性的作用。为此目的可使用阵列技术。所述细胞可能是在空间上分开的，例如在微量滴定板的孔中。
在一个实施方案中，可使用小分子文库。对于“小分子”，本发明人是指其分子量可小于约50kDa的分子。在一个具体的实施方案中，小分子的分子量可小于约30kDa，例如小于约15kDa或小于约10kDa等。这样的小分子的文库(本文中称作“小分子文库”)可包含多肽；小肽，例如20个氨基酸的肽，或者更少例如15、10或5个氨基酸的肽；简单化合物；等。
替代的或者额外的，可对下文详述的组合文库筛选ZNF145的调节剂或拮抗剂。ZNF145活性的测定法如上文所述。
文库
候选分子文库(例如多肽或核酸文库)可用于筛选本文所述的ZNF145的拮抗剂或抑制剂。可将这样的文库暴露于ZNF145蛋白质，并且确定它们对所述蛋白活性的作用(如果有的话)。
分离大文库中所需成员的选择方案是本领域中已知的，典型的有噬菌体展示技术。这样的系统--其中多个肽序列被展示于丝状噬菌体表面(Scott and Smith(1990)见上文)--已证明可用于形成抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库，用于对与靶抗原结合的特异性抗体片段的体外选择和扩增。将编码VH和VL区域的核苷酸序列连接至编码前导信号的基因片段，所述前导序列将它们导向大肠杆菌(E.coli)的周质空间并且结果是所得到的抗体片段展示于所述噬菌体表面，一般是作为与噬菌体外壳蛋白(例如，pIII或pVIII)的融合物的形式。或者，将抗体片段在外部展示在λ噬菌体衣壳(phagebody)上。基于噬菌体的展示系统的优势是，由于它们是生物系统，可通过在细菌细胞中培养包含所选择的文库成员的噬菌体而简单地扩增所选择的文库成员。此外，由于编码所述多肽文库成员的核苷酸序列是被包含在噬菌体或噬菌粒载体上，测序、表达和随后的遗传操作相对容易。
构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域中公知的(McCafferty et al.(1990)见上文；Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134；Hoogenboom et al.(1991)NucleicAcids Res.，19：4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al.(1991)Gene，104：147；Marks et al.(1991)见上文；Barbas et al.(1992)见上文；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks et al.，1992，J Biol.Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313，以引用的方式纳入本文)。若需要，可将这样的技术加以修改，以用于多肽文库的一般表达。
一个尤其有利的方法使用了scFv噬菌体文库(Bird，R.E.，et al.(1988)Science 242：423-6，Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，87：1066-1070；McCaffer et al.(1990)见上文；Clackson et al.(1991)见上文；Marks et al.(1991)见上文；Chiswell et al.(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks et al.(1992)见上文)。已经描述了在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的多种实施方案。还已知对噬菌体展示技术的细微改良，例如在WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearch Council et al.)和WO97/08320(Morphosys，见上文)中所述，它们都以引用的方式纳入本文。
可选文库选择技术包括噬菌体λ表达系统，其可作为噬菌体噬斑或作为溶素原菌落而被直接筛选，两者在以前都已有记载(Huse et al.(1989)Science，246：1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并且可用于本文描述的方法和组合物中。这些表达系统可用于筛选大量不同的文库成员，约106或甚至更大的数量级。其他筛选系统依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早先的方法包括在一组针(pin)和棒(rod)上合成肽，例如WO84/03564中所描述。涉及小珠上肽合成的类似方法在美国专利No.4,631,211中有描述，所述方法形成其中每个小珠均是个体文库成员的肽文库，相关的方法在WO92/00091中有描述。对基于小珠的方法的显著改进涉及用独特的标识标签(例如寡核苷酸)对每个小珠加标签，以有利于鉴定每个文库成员的氨基酸序列。这些经改良的基于小珠的方法在WO93/06121中有描述。
另一种化学合成方法包括在表面以如下方式合成肽(或肽模拟物)阵列，所述方式为将每个不同的文库成员(例如独特的肽序列)置于所述阵列上不连续的预先确定位置。每个文库成员的种类均通过它在所述阵列中的空间位置确定。确定所述阵列中预先确定的分子(例如受体)与反应性文库成员之间发生结合相互作用的位置，从而基于空间位置鉴定所述反应性文库成员的序列。这些方法在美国专利No.5,143,854；WO90/15070和WO92/10092；Fodor et al.(1991)Science，251：767；Dower and Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26：271中有描述。
生成多肽或核苷酸文库的其他系统包括使用用于体外合成所述文库成员的无细胞酶促体系。在一种方法中，通过针对靶配体的选择和PCR扩增的交替进行来选择RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249：505；Ellington and Szostak(1990)Nature，346：818)。可使用类似的技术来鉴定与预先确定的人转录因子结合的DNA序列(Thiesen andBach(1990)Nucleic Acids Res.，18：3203；Beaudry and Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和WO92/14843)。以相似的方式，可将体外翻译作为产生大文库的方法用于合成多肽。通常包括稳定化的多核糖体复合物的这些方法还在WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536中有描述。非基于噬菌体的可选展示技术(例如在WO95/22625和WO95/11922(Affymax)中公开的那些展示技术)使用多核糖体来展示用于选择的多肽。这些文件和所有前述文件都以引用的方式纳入本文。
所述文库可具体地包括锌指文库；锌指是本领域中已知的并且发挥转录因子的作用。合适的锌指文库在例如WO 96/06166和WO98/53057中公开。锌指文库的构建可利用用于确定与特定DNA序列的相互作用的规则，如例如WO 98/53058和WO 98/53060中所公开。能与甲基化的DNA特异性相互作用的锌指在WO 99/47656中公开。上述锌指文库可以阵列的形式固定，例如WO 01/25417中所公开。
可以将经历所述测定法并且被发现值得关注的候选分子分离并进行进一步研究。目的分子的分离方法将依赖于所用的分子的类型，它是否是文库的形式，任意一次可测试多少候选分子，之后是否为分批步骤等。
所述候选分子可以文库的形式提供。在一个实施方案中，可同时筛选超过一种候选分子。通过本领域中已知方法，可生成候选分子文库，例如小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(例如组合文库)、反义分子(例如反义DNA或反义RNA)文库和抗体文库等。这样的文库适于高通量筛选。可将软骨形成祖细胞(如间充质干细胞)暴露于所述文库的个体成员，并确定对软骨发生的作用(如果有的话)。为此目的可使用阵列技术。所述细胞可能是在空间上分开的，例如在微量滴定板的孔中。
在一个实施方案中，可使用小分子文库。对于“小分子”，本发明人是指其分子量可小于约50kDa的分子。在一个具体的实施方案中，小分子的分子量可小于约30kDa，例如小于约15kDa或小于约10kDa等。这样的小分子的文库(本文中称作“小分子文库”)可包含多肽；小肽，例如20个氨基酸的肽，或者更少例如15、10或5个氨基酸的肽；简单化合物；等。
在细胞群中检测软骨形成间充质干细胞
本文描述的多核苷酸探针和抗体可用于检测间充质干细胞，所述间充质干细胞是软骨发生性的，具有软骨发生潜力，或者在细胞群中能以软骨发生通路分化。本文所用的“细胞群”是可包含一种或多种细胞例如间充质干细胞的细胞集合。例如，所述细胞集合可以不只是由间充质干细胞构成，而是还可包含至少一种其他细胞类型。
细胞群包括胚胎和胚胎组织，而且还包括成体组织和培养物中培养的组织以及来自任何上述组织的细胞制品。
本文所述的多核苷酸可用于通过核酸杂交技术检测间充质干细胞中的ZNF145转录物。这样的技术包括PCR，在所述PCR中引物可与ZNF145转录物杂交并且用于扩增所述转录物，以提供可检测的信号；以及经标记的探针的杂交，其中对所述ZNF145转录物中独特序列特异性的探针用于检测所述靶细胞中的转录物。
如上文所述，如本领域中已知的，探针可被放射性标记物、不透射线标记物、荧光标记物或其他标记物标记。
可通过本领域中已知方法生成的ZNF145抗体还可用于检测ZNF145。例如，胞内scFv可用于检测细胞内的ZNF145。
特别指出的是免疫染色和FACS技术。合适的荧光团是本领域中已知的，包括化学荧光团和荧光多肽，如GFP及其突变体(参见WO97/28261)。通过在合成免疫球蛋白分子过程中将化学荧光团结合位点整合在所述免疫球蛋白分子中，可将化学荧光团连接在所述免疫球蛋白分子上。
所述荧光团可包括荧光蛋白，所述荧光蛋白可有利地为GFP或其变体。GFP及其变体可通过如下方式与所述免疫球蛋白或靶分子一起合成：根据本领域中公知的方法，与其作为融合多肽形式表达。例如，可将转录单元构建为所需GFP和所述免疫球蛋白或靶的框内融合物，并使用常规PCR克隆和连接技术将其插入至如上所述的载体中。
抗ZNF145的抗体可用能够生成信号的任何标记物标记。所述信号可以是任何可检测信号，例如诱导可检测基因产物的表达。可检测基因产物的实例包括生物发光多肽，例如荧光素酶和GFP；可由特定测定法检测的多肽，例如β-半乳糖苷酶和CAT；以及可调节所述宿主细胞的生长特点的多肽，例如代谢所需的酶如HIS3；或者抗生素抗性基因如G418。例如，所述信号可在细胞表面或细胞内检测。例如，所述信号可以是可从细胞外面检测到并且使得可通过FACS或其他光学分选技术进行细胞分选的发光信号或荧光信号。
可使用基于对荧光标记抗体的光学检测的光学免疫传感器技术。免疫传感器是包含偶联到信号转导物上的抗原或抗体种类的生物化学检测器，所述信号转导物可检测互补种类的结合(Rabbany et al.，1994Crit Rev Biomed Eng 22：307-346；Morgan et al.，1996 Clin Chem42：193-209)。这类互补种类的实例包括抗原Zif268和抗Zif268的抗体。免疫传感器可产生对存在于复合样本(例如血清或全血)中的抗体、抗原或半抗原量的定量量度(Robinson 1991Biosens Bioelectron6：183-191)。免疫传感器的敏感度使它们对于需要速度和精确的情况是理想的(Rabbany et al.，1994Crit Rev Biomed Eng 22：307-346)。
免疫感应器所使用的检测技术包括对免疫相互作用的电化学检测、压电检测或光学检测(Ghindilis et al.，1998Biosens Bioelectron1：113-131)。间接的免疫感应器使用单独的标记物质，所述标记物质可通过例如荧光或发光(luminescence)在结合后检测到(Morgan et al.，1996Clin Chem 42：193-209)。直接免疫传感器可通过电位差、电流、电阻、质量、热或光学特性的变化来检测结合(Morgan et al.，1996ClinChem 42：193-209)。间接的免疫感受器由于非特异性结合而遇到较少的问题(Attridge et al.，1991Biosens Bioelecton 6：201-214；Morgan etal.，1996Clin Chem 42：193-209)。
药物组合物
本文描述的软骨发生促进剂(包括ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞)可以以生物活性的形式以低成本大量产生，使得可开发通过烟雾化、喷雾法、鼻内、气管内等给药的含软骨发生促进剂的制剂。
尽管有可能将包含软骨发生促进剂的组合物单独给药，但可将所述活性成分配制为药物制剂。因此，本发明人还公开了包含本文所述的软骨发生促进剂的药物组合物，所述软骨发生促进剂包括ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞中的一种或多种。这样的药物组合物可用于将软骨发生促进剂递送至个体，以治疗或减轻所述症状。
所述组合物可包括软骨发生促进剂，包括ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞、结构相关的化合物或其酸性盐。所述药物制剂可包括有效量的软骨发生促进剂，例如ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞，以及一种或多种可药用载体。软骨发生促进剂--例如ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞--的“有效量”是足以减轻所述疾病的至少一个症状(例如特应性变态反应)的量。
所述有效量会依赖于待治疗或减轻的具体疾病或症状以及其他因素而变化，所述其他因素包括患者的年龄和体重、疾病等的状态进程、患者的整体健康状况、症状的严重程度以及所述软骨发生成促进剂(例如ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞)是单独给药还是与其他治疗物组合给药。
合适的可药用载体是本领域中已知的并且随着所述药物制剂的所需要形式和给药方式而改变。例如，它们可包括稀释剂或赋形剂，例如填充剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等。所述载体一般是固体、液体、可蒸发载体或其组合。每种载体在如下方面上应是“可接受的”：与所述制剂中的其他成分是相容的并且对病人是无伤害的。当将所述载体给予宿主时应该是生物可接受的，而不诱发不良反应(例如免疫应答)。
本文公开的药物组合物包括适于局部给药和口服给药的那些，例如当受侵染组织基本上是皮肤或表皮时(例如银屑病、湿疹和其他表皮疾病)可使用局部制剂。所述局部制剂包括其中通过与待治疗的皮肤表面直接接触而外部施用所述组合物的那些药物形式。局部应用的常规药物形式包括浸泡剂、软膏剂、乳剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、棒剂、喷雾剂、气雾剂、浴油剂、溶液剂等。局部治疗物可通过多种载体递送，载体的选择可能是重要的，并且一般与待治疗的是急性疾病还是慢性疾病有关。局部应用的其他制剂包括洗发剂、肥皂剂、摇荡剂(shake lotion)等，尤其是那些配制为在下面皮肤(例如头皮)上留下残余物的那些(Arndt et al，in Dermatology In General Medicine2：2838(1993))。
一般而言，在局部制剂中，软骨发生促进剂(例如ZNF145核酸、ZNF145多肽、ZNF145激动剂和ZNF145过表达细胞)的浓度是所述组合物重量的约0.5至50％，例如约1至30％，约2-20％或约5-10％。所使用的浓度最初可以是所述范围的上部分，随着治疗的持续，可将所述浓度减低或者可以降低所述制剂的施用频率。局部施用经常是每天施用2次。但是，较大剂量的每天一次施用或者较小剂量的更频繁施用可能会是有效的。角质层可起到储存库的作用，并且可使药物在较长的时间里逐步渗透进入活的皮肤层中。
在局部施用中，足量的活性成分必须穿透患者的皮肤，目的是获得所需要的药物效果。一般认为，药物吸收进入皮肤是药物性质、载体性能和皮肤的函数。三个主要的变量是如下方面中差异的原因：不同局部药物或不同载体中同一药物的吸收速率或流动率；载体中的药物浓度、角质层和载体之间的药物分配系数以及角质层中的药物扩散系数。为了有效进行治疗，药物必须穿过负责皮肤屏障功能的角质层。呈现高体外皮肤渗透性的局部制剂一般在体内是有效的。Ostrenga等人(J.Pharm.Sci.，60：1175-1179(1971))证明，局部施用的类固醇在体内的效力与在体外切下的人皮肤中的类固醇渗透率成比例。
可将皮肤病学可接受并且与所述试剂相容的皮肤渗透增强剂整合至所述制剂中，以增强活性化合物从皮肤表面向表皮角化细胞中的渗透。可增加活性化物吸收至皮肤中的皮肤增强剂可减少有效治疗所需要的试剂量，并且可为所述制剂提供较长时间的持续作用。皮肤渗透增强剂是本领域中公知的。例如，二甲基亚砜(美国专利No.3,711,602)；油酸，1，2-丁二醇表面活性剂(Cooper，J.Pharm.Sci.，73：1153-1156(1984))；乙醇与油酸或油醇的结合物(EP 267,617)，2-乙基-1，3-己二醇(WO 87/03490)；癸基甲基亚砜和Azone.RTM.(Hadgraft，Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21：165-173(1996))；醇、亚砜、脂肪酸、酯、Azone.RTM.、吡咯烷酮、尿素和多元醇(Kalbitzet al，Pharmazie，51：619-637(1996))；
已知萜，例如1，8-桉油素、薄荷酮、柠檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy & Pharmocology，47：978-989(1995))；Azone.RTM.和二乙二醇单乙基醚(Transcutol)(Harrison et al，Pharmaceutical Res.13：542-546(1996)：以及油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh et al，Pharmazie，51：741-744(1996))可改善活性成分的皮肤渗透。
试剂或组合物的渗透水平可通过本领域技术人员已知的技术确定。例如，对活性化合物进行放射性标记，然后测量由皮肤吸收的经放射性标记的化合物的量，这样能使本领域技术人员使用多种确定测试化合物皮肤渗透性的方法中的任一种来确定所吸收组合物的水平。关于皮肤渗透性研究的出版物包括Reinfenrath，W G and G SHawkins.The Weaning Yorkshire Pig as an Animal Model forMeasuring Percutaneous Penetration.In：Swine in BiomedicalResearch(M.E.Tumbleson，Ed.)Plenum，New York，1986，andHawkins，G.S.Methodology for the Execution of In Vitro SkinPenetration Determinations.In：Methods for Skin Absorption，B WKemppainen and W G Reifenrath，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1990，pp.67-80；和W.G.Reifenrath，Cosmetics&Toiletries，110：3-9(1995)。
对于一些应用，可使用本领域中已知的制剂(例如聚合物)给予长效形式的试剂或组合物。可将所述试剂按照本领域中已知的方法纳入皮肤小片(Junginger，H.E.，in Acta Pharmaceutica Nordica 4：117(1992)；Thacharodi et al，in Biomaterials 16：145-148(1995)；Niedner R.，in Hautarzt 39：761-766(1988))或绷带中，以增强将所述药物递送至待治疗区域的效力。
任选地，所述局部制剂可以有另外的赋形剂，例如：防腐剂例如羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸或季铵化合物；稳定剂例如EDTA；抗氧化剂例如丁基化羟基甲苯或丁基化羟基苯甲醚；以及缓冲剂例如柠檬酸盐和磷酸盐。
所述药物组合物可以口服制剂形式给药，所述口服制剂可以是片剂、胶囊剂或溶液剂的形式。每天1至3次向患者给予有效量的所述口服制剂，直到所述疾病的症状减轻。试剂的有效量依赖于患者的年龄、体重和病症。一般而言，试剂的每日口服量少于1200mg，并且超过100mg。所述每日口服剂量可以是约300-600mg。口服制剂一般以单位剂量的形式呈现，并且可通过制药领域中已知的任何方法制备。可将所述组合物与合适的可药用载体一起配制成任何所需的剂量形式。常规的单位剂型包括片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、悬液剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂。一般而言，所述制剂可通过以下方式制备：使所述试剂组合物与液体载体和/或极细的固体载体均匀且彻底地结合，并且根据需要将产物成型。可将所述活性成分整合至多种液体、粉末、片剂或胶囊形式的基础材料中以给出有效量的活性成分来治疗疾病。
适于本文使用的其他治疗剂是对所述预定目的有效的任何相容性药物，或者是补充所述试剂制剂的药物。在联合疗法中使用的制剂可与其他治疗同时或贯序给药，使得达到联合的效果。
ZNF145过表达细胞的给药
本发明人描述了将ZNF145过表达细胞给予个体。
用ZNF145过表达细胞对个体的治疗性或预防性治疗在疾病、失调或病症以任何方式发生可测定的改善时被认为是有效的。这样的改善可通过多种指标显示。可测量的指标包括例如与具体疾病、失调或病症相关的一种生理状况或一组生理状况(包括但不局限于血压；心率；呼吸速率；各种血细胞类型的计数；某些蛋白质、碳水化合物、脂质或细胞因子在血液中的水平；或者与所述疾病、失调或病症相关的基因标记物的调节表达)中可检测的变化。在以下情况下认为以ZNF145过表达细胞对个体的治疗是有效的：如果上述指标中的任一种对这类治疗的反应是变成在正常值内或接近正常值的值。所述正常值可通过本领域中已知对于各种指标的正常范围来确立，或者可通过与对照中的这类值比较来确立。在医疗科学领域中，治疗的有效性还经常表征为个体的感观和个体健康状态的主观感受。因此，改善还可以通过主观指标表征，所述主观指标例如在给予本文所述的ZNF145过表达细胞后对改善的个体主观感受、改善的安康、改善的健康状态、提高的精力水平等。
可将本文描述的ZNF145过表达细胞以任何可药用的或可医用的方式给予患者，所述方式包括通过注射或输液。所述ZNF145过表达细胞可包含任何可药用载体或被包含在任何可药用载体中。所述ZNF145过表达细胞可在任何可药用的或可医用的容器中携带、储存或运送，所述容器例如血袋、转移袋、塑料管或小瓶。
实施例
实施例1.MSC培养物以及成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的分化
在知情同意后，根据新加坡国立大学医院(National UniversityHospital of Singapore)的准则，如(Sekiya et al.，2002)所述将源自人骨髓的间充质干细胞(hBMSC)从髂嵴中收集并培养。
为防止自发分化，将细胞保持在亚汇合(subconfluent)水平。如(Liu et al.，2007)所述，将MSC诱导向脂肪细胞和成骨细胞的分化，将W6板中2×105和1.5×105MSC分别在脂肪形成和成骨培养基中诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞，持续14天。
脂肪形成培养基包含0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松(Sigma)、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛和1％抗生素/抗真菌剂。成骨培养基包含0.1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸酯、10mM β-甘油磷酸酯和1％抗生素/抗真菌剂。
将(Liu et al.，2007)所述的团块培养系统用于软骨细胞分化。简言之，将2×105MSC置于15ml聚丙烯管(Falcon)中并且离心成为块状沉淀物。将所述块状沉淀物在37℃和5％CO2下在包含10ng/ml转化生长因子(TGF)-β3、10-7M地塞米松、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、40μg/ml脯氨酸、100μg/ml丙酮酸盐和50mg/ml ITS+Premix(Becton Dickinson、6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、1.25mg/ml BSA和5.35mg/ml亚油酸)的500μl软骨形成培养基中培养。每3-4天更换一次培养基，持续28天。
MSC的分化可通过实时PCR和染色评估。在本研究中，在脂肪生成中用油红O染色类脂沉淀物，在骨发成中用茜素红S染色钙沉淀，在软骨发生中免疫染色2型胶原(COL2A1)并用阿辛蓝染色软骨蛋白聚糖。
实施例2.表达质粒的构建和感染至MSC
从进行骨发生14天的MSC的cDNA扩增ZNF145，然后将其克隆至pEntry3C(Invitrogen)中。
Sox9 ultimate ORF克隆来自Invitrogen。通过pEntry3C和pLenti6/V5(Invitrogen)之间的LR重组，产生用于过表达ZNF145或Sox9的pLentiviral载体。慢病毒是通过将用于过表达ZNF145或Sox9的pLentiviral载体和packaging mix(Invitrogen)共转染至293FT细胞中而产生，然后用病毒上清液感染MSC以实现ZNF145或Sox9过表达，并将所述MSC用5μg/ml杀稻瘟菌素选择7天。将无插入物的空pLenti6/V5用作对照(空)。
实施例3.定量实时PCR
为了定量ZNF145过表达或敲除对MSC分化的作用，用Taqman表达测定法(按照制造商所述)和ABI 7700Prism  (AppliedBiosystems)进行定量实时PCR。
简言之，使用大容量cDNA库试剂盒将0.3μg总RNA转变为30ul的cDNA，然后将其稀释至300μl。定量RT-PCR按如下进行：在50℃下2分钟、95℃下10分钟进行初始变性，随后使用5μl的2×Mastermix、0.5μl的Taqman探针和4.5μl的cDNA进行40个PCR循环(95℃下15秒，60℃下1分钟)。
将所有探针都被设计为具有5’荧光生成性的6-羧基荧光素和3’猝灭物--四甲基-6-羧基若丹明。将人GAPDH的表达用于对基因表达水平进行标准化。
实施例4.间接免疫荧光细胞染色
将生长在腔室上的细胞用PBS洗涤，并在室温下用10％的中性福尔马林固定15分钟。
用Rinse缓冲液(1×TBS+0.05％Tween 20)洗涤两次后，将细胞用0.1％Triton X-100/PBS透化10分钟。将所述细胞用4％的山羊血清(封闭缓冲液)处理30分钟，然后用以1∶50稀释在封闭缓冲液中的抗ZNF145一抗孵育1小时。
用Rinse缓冲液冲洗3次后，将所述细胞用以1∶150稀释在PBS中的FITC-缀合二抗孵育45分钟。在洗涤三次后，用荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)检查免疫位置(immunolocation)。
实施例5.蛋白质印迹分析
通过离心收集细胞，在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(25mMTris，pH7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中重悬细胞块状沉淀物，并将其在冰上孵育30分钟。
在4℃下以16000g下离心15分钟后，收集包含总细胞提取物的上清液，并将其保持在-80℃下。将凝胶中来自细胞提取物的蛋白质电泳转移至Hybond-PVDF膜(Amersham Biosciences)上。在室温下将所述膜在封闭缓冲液(包含5％脱脂乳的TBS-T)中孵育1小时以封闭非特异性蛋白结合，然后在室温下与稀释(1∶300)于封闭缓冲液中的抗ZNF145或Sox9的一抗孵育1小时。
用TBS-T洗涤4次后，将所述膜与稀释(1∶3000)于封闭缓冲液中的HPR-缀合的二抗孵育1小时。用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham Biosciences)可视化抗体结合。
实施例6.cDNA微阵列分析
为了确定MSC中的ZNF145的靶，本发明人在MSC中过表达了ZNF145，并使用微阵列分析了它们在未分化MSC中的基因表达谱。
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根据制造商的方案从ZNF145过表达的MSC和无插入物的对照MSC中分离总RNA。简而言之，用一次循环cDNA合成试剂盒将3.5μg总RNA用于合成双链DNA。使用Sample Cleanup Module纯化cDNA。使用GeneChip IVT Labeling试剂盒进行体外转录以产生经生物素标记的cRNA。用Sample Cleanup Module使经生物素化的cRNA变纯净并片段化成50-200个核苷酸，并且在45℃下与包含超过54675个人基因的Affymetrix HG U133plus 2杂交16小时。
洗涤后，将所述阵列用链亲和素-藻红蛋白(Molecular Probes)染色。将所述染色信号通过经生物素化的抗-链亲和素(VectorLaboratories)放大，然后通过链亲和素-藻红蛋白染色，随后在GCOS3000(Affymetrix)上扫描。
使用软件Genespring V7.3分析所述数据。将对经标准化的强度的t检验以及随后的比值变化(标准化强度的比值≥2或≤-2)用于产生在基因表达谱中有显著变化的基因列表。在该研究中，使用来自2名患者的一式两份MSC。
实施例7.人MSC至大鼠中的移植和组织学评估
用腹腔内注射的克他命(10mg/100g)和甲苯噻嗪(1mg/100g)的混合物将雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(500g)麻醉。
在膝盖皮肤上制造前部中线切口。通过内侧髌骨切开术(parapatellar-medial approach)打开膝关节并使髌骨外翻。在股骨远端的髌骨沟上制造骨软骨缺陷(直径1.5mm，深1.5mm)。3只大鼠接受块状沉淀物，其中有ZNF145过表达的hMSC移植至右膝盖，对照hMSC移植至左膝盖。在移植前，在体外将来自块状沉淀的3×105个ZNF145过表达hMSC的块状沉淀物诱导进入软骨细胞分化，持续1周(Johnstone et al.，1998)。
将带有无插入物对照MSC的块状沉淀物的缺陷用作对照。所述受体动物在手术之后立即开始每天接受皮下注射的环孢菌素(14mg/kg，Novartis Pharma AG，Basel，Switherland)。
在手术后6周，每次处死来自各组的3只大鼠。收集有缺陷的股骨远端，固定在10％缓冲的福尔马林(formation)中，并且将所述组织脱钙并切成5μm的切片。用苏木精/曙红、阿辛蓝对软骨蛋白聚糖进行染色，并进行Col2A1免疫染色。
根据Wakitani等人(1994)描述的组织学评分表对每个样本进行分级。所述评分表由5类组成：细胞形态、基质着色、表面规则性、软骨厚度以及供体与宿主软骨的整合度。评分为0(正常关节软骨)至14(没有软骨组织)。
实施例8.结果：ZNF145在体外软骨发生中的表达模式
实时PCR的定量数据(图1)显示，ZNF145在MSC的3个谱系分化的早期和晚期一般被上调。
对ZNF145的免疫荧光显示，ZNF145在3个谱系分化过程中被上调并且定位于核，而ZNF145在未分化的MSC中不表达(图1B和图1C)。
实施例9.结果：ZNF145敲低对3个谱系分化的作用
在MSC的3个谱系分化过程中ZNF145被证明为共同的上调基因。
构建两个靶向ZNF145的shRNA，显示于如下实验步骤中。将靶向ZNF145的shRNA通过lentiviral pLL3.7有效地引入至MSC(图2A)中。通过siRNA对ZNF145的基因沉默下调了通过实时PCR定量的3个谱系标记物(图2B和图2C)。所述结果表明，ZNF145在MSC分化中起重要作用。这些与对于3个分化谱系的染色是一致的。
敲低ZNF145的MSC显示出在脂肪形成中对于油滴的油红染色下降、在软骨发生中对于主要胶原的Col2a1染色和对于硫酸蛋白聚糖基质的阿辛蓝染色下降，并且在骨发生中对于钙沉积的茜素红染色下降(图2D)。
实施例10.结果：ZNF145过表达对软骨发生和骨发生的作用
为了评估ZNF145过表达对MSC分化的作用，用慢病毒感染MSC，目的是稳定的ZNF145表达。
免疫染色显示ZNF145在MSC的核中过表达，而ZNF145在未分化的MSC中不表达(图3A)。
然后，在团块培养下将ZNF145过表达的MSC诱导进入软骨发生持续28天，进入骨发生持续14天。
ZNF145在MSC中的过表达可促进软骨发生中表达col2A1达12.64倍、聚集蛋白聚糖达7.92倍、col10A1达7.5倍和sox9达2.45倍(图3B)，表明ZNF145可促进软骨发生。
该发现被在软骨中对col2A1的免疫染色和对蛋白聚糖的阿辛蓝染色进一步证实(图3C)。
在骨发生中，与无插入物的对照相比，在ZNF145过表达的MSC中观察到骨钙素、碱性磷酸酶和col1A1的上调(图3B)。这与骨发生中钙沉积的茜素红染色(图3C)和碱性磷酸酶的AP染色(图3D和图3E)是一致的，表明ZNF145过表达可改善骨发生。
实施例10A.ZNF145过表达可改善MSC细胞系的软骨发生和骨发生
原代MSC面临的问题是寿命有限以及不同受体之间有差异。为了克服原代MSC的这些缺点，通过逆转录病毒系统用hTERT和来自SV40的抗原大T的组合生成了MSC细胞系。MSC细胞系表现出与原代MSC相似的表面抗原谱，并且具有向3个谱系(脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞)的分化潜能。
为了测试MSC细胞系的肿瘤发生，在每个位点将5×106个MSC细胞经皮下植入至5只裸鼠和5只NOG小鼠，在第12周时没有观察到肿瘤。
发明人的发现表明，ZNF145过表达在MSC细胞系中具有与在原代MSC中相似的作用，ZNF145在MSC细胞系中的过表达增强了软骨发生和骨生成标记物的表达(图3F)，这与以下现象是一致的：在软骨分化中经Col2A1免疫染色的Col2A1和硫酸蛋白聚糖基质的阿辛蓝染色增加，在骨发生中经茜素红染色的钙沉积(图3G)以及经AP染色(图3H)和AP测定(图3I)的碱性磷酸酶增加。
实施例11.结果：MSC中ZNF145的靶
为了阐明ZNF145过表达对MSC的作用的内在机制，发明人在来自两位患者的MSC中过表达ZNF145，然后通过微阵列检查它在一式两份MCS中的靶。
发明人的数据显示，在未分化的MSC中，423个基因被ZNF145过表达上调，而678个基因被ZNF145过表达下调(图4A)。
来自两位患者的MSC在ZNF145过表达时显示出相似的表达模式(图4B)。
随后，通过RT-PCR比较经微阵列分析的平行样本中选定基因的表达模式，用以进行验证。RT-PCR测定法与微阵列数据是一致的(图4C)。
实施例12.结果：ZNF145作为Sox9的上调调节物调节软骨发生
Sox9是软骨发生期间的主要调节物。为理解ZNF145在软骨发生期间如何起作用，确定ZNF145和Sox9之间的关系是至关重要的。
将Sox9和ZNF145引入至MSC中。在RNA(图5A)和蛋白质水平(图5B)上，ZNF145在MSC中的过表达可增强Sox9的表达，而Sox9的过表达不会增强ZNF145的表达。该发现表明ZNF145是Sox9的上游调节物。
实施例13.ZNF145在体内大鼠模型中改善了对软骨缺陷的修复
为了评估ZNF145过表达的MSC是否会在体内改善对软骨缺陷的修复质量，本发明人比较了过表达ZNF145的MSC和无插入物的对照MSC，其中所述对照MSC已经在团块培养条件下进行了7天的体外软骨发生，然后被移植入至大鼠膝盖的骨软骨缺陷处。
所述动物接受者在手术之后立即开始每日接受皮下注射的环孢菌素(14mg/kg)。在植入后6周，所述缺陷处被以类似于透明软骨的修复组织填充。
来自ZNF145-MSC移植物的表层与对照MSC相比具有更强的基质着色。在更高放大率下，所述细胞类似于高度分化的软骨细胞并且被异染性的基质包围。
所述ZNF145组显示出连续并且相似的对于硫酸蛋白聚糖基质的阿辛蓝染色以及对于软骨和邻近软骨之间主要胶原的Col2A1免疫染色，而所述无插入物的对照MSC组在缺陷部位显示出不连续的阿辛蓝染色和Col2A1免疫染色。最重要的是，来自ZNF145-MSC的软骨与相邻软骨的两边都很好地整合(图6A和6B)。
根据Wakitani et al(1994)，基于细胞形态、基质着色、表面规则性、软骨厚度以及供体与宿主邻近软骨的整合度来确定组织分级评分，以比较所述ZNF145和无插入物的对照组之间的修复组织。
ZNF145组的分级评分显著优于无插入物组(图6C)。这些结果表明，ZNF145过表达的MSC能比对照组更好且更早地修复软骨缺陷，ZNF145组具有更好的软骨。
与在第6周时的修复效果类似，与对照MSC相比，ZNF145组在第12周时显示出更好的修复效应(图6D和6E)。ZNF145组在第12周时的分级评分大大优于对照组(图6F)。
这些结果表明，ZNF145改善了对软骨缺陷的修复质量并且能够更好且更早地进行修复。这些发现表明，ZNF145疗法是可以用于软骨再生和修复的有效策略。
实施例15.间充质干细胞系的生成
除端粒酶之外还可以表达病毒蛋白质，以使间充质干细胞系无限增殖化。重复上述实验以产生可表达(a)hTERT和SV-40大T抗原；(b)hTERT+HPV E7；(c)hTERT+HPV E6+HPV E7；或(d)hTERT+bmi-1+HPV E6的间充质干细胞系。
生成间充质干细胞系的简单方法包括步骤：(a)如上文所详述，生成慢病毒表达载体；(b)单独地生成病毒(参见实施例--材料和方法)；(c)用病毒共转染骨髓-MSC(或其他类型的MSC，包括脂肪组织-MSC、ES-MSC等)或者用上述组合一个接一个感染MSC；(d)连续传代以测试所生成的具有上述组合的MSC是否是无限增殖系，并且还检测它们的分化潜能，包括软骨分化。
结果
如上文所述产生表达hTERT+大T抗原的间充质干细胞系。数据表明，这种组合可延长骨髓-MSC的寿命至第25次传代，其中在第15次传代时无基因对照MSC发生老化。所生成的MSC显示出良好的MSC形态，以及向骨、软骨和脂肪分化的3个谱系。
参考文献
参考文献1-13与背景技术有关：
1.Buckwalter JA.Articular cartilage injuries.Clin Orthop，2002：21-37.
2.Martin JA，Buckwalter JA.Aging，articular cartilage chondrocyte senescence andosteoarthritis.Biogerontology 2002；3：257-264.
3.Weissman IL.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic：barriersand opportunities.Science 2000；287：1442-1446.
4.Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.Science 1999；284：143-147.
5.Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies.Tissue Eng 2001；7：211-228.
6.Pountos I，Jones E，Tzioupis C，et al.Growing bone and cartilage：The role ofmesenchymal stem cells.J Bone Joint Surg Br 2006；88：421-426.
7.Horwitz EM，Gordon PL，Koo WK，et al.Isolated allogeneic bone marrow-derivedmesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta：Implications for cell therapy of bone.Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：8932-8937.
8.Chamberlain JR，Schwarze U，Wang PR，et al.Gene targeting in stem cells fromindividuals with osteogenesis imperfecta.Science 2004；303：1198-1201.
9.Arinzeh TL，Peter SJ，Archambault MP，et al.Allogeneic mesenchymal stem cellsregenerate bone in a critical-sized canine segmental defect.J Bone Joint Surg Am 2003；85-A：1927-1935.
10.Quarto R，Thomas D，Liang CT.Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity.Calcif Tissue Int 1995；56：123-129.
11.D’Ippolito G，Schiller PC，Ricordi C et al.Age-related osteogenic potential ofmesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow.J Bone Miner Res 1999；14：1115-1122.
12.Muraglia A，Cancedda R，Quarto R.Clonal mesenchymal progenitors from humanbone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.J Cell Sci 2000；113：1161-1166.
13.Guilak F，Lott KE，Awad HA，et al.Clonal analysis of the differentiation ofpotential ofhuman adipose-derived adult stem cells.J Cell Physiol 2006；206：229-237.
以下的参考文献涉及说明书(除背景技术之外)
Akiyama H，Chaboissier MC，Martin JF，Schedl A，De Crombrugghe B.Thetranscription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocytedifferentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.Genes Dev.2002，16：2813-2828.
Barna M，Hawe N，Niswander L，Pandolfi PP.Plzf regulates limb and axial skeletalpatterning.Nature，2000，25：166-172.
Bell DM，Leung KK，Wheatley S，Ng LJ，Zhou S，Ling KW，Sham MH，Koopman P，Tam PP，Cheah KS.Sox9 directly regulates the type-II collagen gene.Nature，1997，16：174-178.
Bi W，Deng JM，Zhang Z，Behringer RR，de Crombrugghe B.Sox9is required forcartilage formation.Nat Genet.，1999，22：85-89.
Bridgewater LC，Lefebvre V，De Crombrugghe B.Chondrocyte-specific enhancerelements in the Col11 a2 gene resemble the Col2altissue-specific enhancer.J Biol Chem，1998，273：14998-15006.
Buckwalter JA.Articular cartilage injuries.Clin Orthop，2002：21-37.
Chen Z，Brand NJ，Chen A，Chen SJ，Tong JH，Wang ZY，Waxman S，Zelent A.Fusion betweera novel Krüppel-like zinc finger gene and the retinoic acid receptor-alphalocus due to a variant t(11；17)translocation associated with acute promyelocytic leukaemia.EMBO J，1993，12(3)：1161-1167.
Cook M，Gould A，Brand N，Davies J，Strutt P，Shaknovich R，Licht J，Waxman S，Chen Z，Gluecksohn-Waelsch S，Krumlauf R，Zelent A.Expression of the zinc-finger genePLZF at rhombomere boundaries in the vertebrate hindbrain.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：2249-2253.
Costoya JA，Hobbs RM，Barna M，Cattorettti G，Manova K，Sukhwani M，Orwig KE，Wolgemuth DJ，Pandolfi PP.Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stemcells.Nature Genet，2004，36：653-659.
Eaves CJ，Cashman JD，Kay RJ，Dougherty GJ，Otsuka T，Gaboury LA，Hogge DE，Lansdorp PM，Eaves AC，Humphries RK.Mechanisms that regulate the cell cycle status ofvery primitive hematopoietic cells in long-term human marrow cultures.II.Analysis ofpositive and negative regulators produced by stromal cells within the adherent layer.Blood，1991，78：110-117.
Foster JW，Dominguez-Steglich MA，Guioli S，Kwok C，Weller PA，Stevanovic M，Weissenbach J，Mansour S，Young ID，Goodfellow PN，Brook JD，Schafer AJ.Campomelicdysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY-related gene.Nature，1994，372：525-530.
Furumatsu T，Tsuda M，Taniguchi N，Tajima Y，Asahara H.Smad3 induceschondrogenesis through the activation of SOX9 via CREB-binding protein/p300recruitment.J Biol Chem，2005，280：8343-8350.
Huang W，Chung U，Kronenberg HM，de Crombrugghe B.The chondrogenictranscription factor Sox9 is a target of signaling by the parathyroid hormone-related peptide inthe growth plate of endochondral bones.Proc Natl Acad Sci，2001，98：160-165.
Ikeda R，Yoshida K，Tsukahara S，et al.The promyelotic leukemia zinc fingerpromotes osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells as an upstreamregulator of CBFAl.J Biol Chem 2005；280：8523-8530.
Ikegawa S and Kou I.SOX9-dependent and-independent transcriptional regulation ofhuman cartilage link protein.J Biol Chem，2004，279：50942-50948.
Johnstone B，Hering TM，Caplan AI，Goldberg VM，Yoo JU.In vitro chondrogenesisof bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.Exp Cell Res 1998；238(1)：265-272.
Kawakami Y，Tsuda M，Takahashi S，Taniguchi N，Esteban CR，Zemmyo M，Furumatsu T，Lotz M，Belmonte JCI，Asahara H.Transcriptional coactivator PGC-1αregulates chondrogenesis via association with Sox9.Proc Natl Acad Sci，2005，102：2414-2419.
Lefebvre V，Huang W，Harley VR，Goodfellow PN，De Crombrugghe B.SOX9is apotent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha l(II)collagen gene.MolCell Biol，1997，17：2336-2346.
Liu TM，Martina M，Hutmacher DW，Hui JHP，Lee EH，Lim B.Identification ofcommon pathways mediating differentiation of bone marrow and adipose tissues derivedhuman mesenchymal stem cells(MSCs)into three mesenchymallineages.Stem cells，2007，25：250-260.
Martin JA，Buckwalter JA.Aging，articular cartilage chondrocyte senescence andosteoarthritis.Biogerontology 2002；3：257-264.
Melnick AM，Westendorf JJ，Polinger A，Carlile GW，Arai S，Ball HJ，Lutterbach B，Hiebert SW，Licht JD.The ETO protein disrupted in t(8；21)-associated acute myeloidleukemia is a corepressor for the promyelocytic leukemia zinc finger protein.Mol Cell Biol.，2000，20(6)：2075-2086.
Murakami S，Kan M，McKeehan WL，de Crombrugghe B.Up-regulation of thechondrogenic Sox9 gene by fibroblast growth factor is mediated by the mitogen-activatedprotein kinase pathway.Proc Natl Acad Sci，2000，97：1113-1118.
Ng LJ，Wheatley S，Muscat GE，Conway-Campbell J，Bowles J，Wright E，Bell DM，Tam PP，Cheah KS，Koopman P.SOX9 binds DNA，activates transcription，and coexpresseswith type II collagen during chondrogenesis inthe mouse.Dev Biol，1997，183：108-121
Ng LJ，Wheatley S，Muscat GE，Conway-Cambell J，Bowles J，Wright E，Bell DM，Tam PP，Cheah KS，Koopman P.SOX9binds DNA，activates transcription，and coexpresseswith type II collagen during chondrogenesis in the mouse.Dev Biol.1997，183(1)：108-121.
Sekiya I，Tsuji K，Koopman P，Watanabe H，Yamada Y，Shinomiya K，Nifuji A，NodaM.SOX9enhances aggrecan gene promoter/enhancer activity and is up-regulated by retinoicacid in a cartilage-derived cell line，TC6.J Biol Chem，2000，275：10738-10744.
Sekiya I，Vuoristo JT，Larson BL，Prockop DJ.In vitro cartilage formation by humanadult stem cells from bone marrow stroma defines the sequence of cellular and molecularevents during chondrogenesis.Proc Natl Acad Sci 2002；99：4397-4402.
Shaknovich R，Yeyati PL，Ivins S，Melnick A，Lempert C，Waxman S，Zelent A，LichtJD.The promyelocytic leukemia zinc finger protein affects myeloid cell growth，differentiation，and apoptosis.Mol Cell Biol，1998，18：5533-5545.
Wakitani S，Goto T，Pineda SJ，Young RG，Mansour JM，Caplan AI，Goldberg VM.Mesenchymal cell-based repair of large，full-thickness defects of articular cartilage.J BoneJoint Surg Am，1994，76(4)：579-592.
Wagner T，Wirth J，Meyer J，Zabel B，Held M，Zimmer J，Pasantes J，Bricarelli FD，Keutel J，Hustert E，Wolf U，Tommerup N，Schempp W，Scherer G.Autosomal sex reversaland campomelic dysplasis are caused by mutations in and around the SRY-related geneSOX9.Cell，1994，79：1111-1120.
Xie WF，Zhang X，Sakano S.Lefebvre V，Sandell LJ.Trans-activation of the mousecartilage-derived retinoic acid-sensitive protein gene by Sox9.J Bone Miner Res，1999，14：757-763.
Zhao Q，Eberspaecher H，Lefebvre V，de Crombrugghe B.Parallel expression of Sox9and Col2al in cells undergoing chondrogenesis.Dev Dyn，1997，209：377-386.
Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，De Ugarte DA，Huang JI，Mizuno H，Alfonso ZC，FraserJK，Benhaim P，Hedrick MH.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.MolBiol Cell 2002；13：4279-4295.
在本文中提及的每件申请和专利，上述每件申请和专利中引用或参考的每份文件(包括在每件申请和专利审查过程中引用或参考的每份文件(“申请引用的文件”))，以及在每件申请和专利中及在申请引用的任何文件中引用或提及的任何产品的任何厂商说明书或目录，据此以引用的方式纳入本文。此外，在本文中引用的所有文件，本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文中引用或提及的任何产品的任何厂商说明书和目录，据此以引用的方式纳入本文。
只要不偏离本发明的范围和主旨，本发明所描述的方法和系统的多种修改和变化方案对本领域技术人员来说是明显的。尽管本发明是结合具体优选实施方案来描述的，但应理解所要求保护的发明不应被不适当地局限于这样的具体实施方案。事实上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说明显的用于实现本发明的所述模式的多种修改意欲包括在权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.一种经工程改造以增加ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性的软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞(MSC)。
2.权利要求1的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞，所述细胞与尚未经这样工程改造的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞相比表现出：
(a)软骨形成标记物的表达增加，所述软骨形成标记物例如2型胶原(COL2A1)、聚集蛋白聚糖、col10A1或Sox 9；
(b)软骨蛋白聚糖分泌增加，例如通过阿辛蓝染色检测到的软骨蛋白聚糖分泌增加；或
(c)修复软骨、骨或韧带缺损的能力提高，例如通过对细胞形态、基质染色、表面规则性、软骨的厚度以及供体与宿主相邻软骨的整合度中任一种或多种的组织学分级检测到的能力提高，例如通过Wakitani等人(1994)描述的组织学分级检测的能力提高；
或者其任意组合。
3.权利要求1或2的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞，其中将所述软骨形成祖细胞，例如间充质干细胞或其前体以可增加ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性的表达构建体转染，所述表达构建体例如慢病毒表达构建体。
4.权利要求1、2或3的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞，所述软骨形成祖细胞例如间充质干细胞已被诱导进入软骨细胞分化，例如通过Liu等人(2007)描述的团块培养系统诱导进入软骨细胞分化，即通过使软骨形成祖细胞例如间充质干细胞形成团块，并且在含有10ng/ml转化生长因子(TGF)-β3、10-7M地塞米松、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯、40μg/ml脯氨酸、100μg/ml丙酮酸盐和50mg/mlITS+Premix(Becton Dickinson、6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、1.25mg/ml BSA和5.35mg/ml亚油酸)的软骨形成培养基中培养。
5.前述权利要求任一项的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞，所述软骨形成祖细胞例如间充质干细胞已被工程改造以增加以下任一种或多种物质的表达或活性：Nanog、Oct4、端粒酶、SV40大T抗原、HPV E6、HPV E7和Bmi-1。
6.一种包含或源自前述权利要求任一项的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞的细胞系，例如无限增殖细胞系或无限增殖化细胞系。
7.一种包含ZNF145序列或者其片段、同源物、变体或衍生物的核酸例如表达载体用于治疗疾病的方法中，所述核酸能够编码包含软骨形成活性的多肽，所述疾病如软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
8.一种包含ZNF145序列或者其片段、同源物、变体或衍生物的多肽用于治疗疾病的方法中，所述ZNF145序列的片段、同源物、变体或衍生物包含软骨形成活性，所述疾病如软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
9.一种包含权利要求1至5任一项的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞、权利要求6的细胞系、权利要求7的核酸或权利要求8的多肽的药物组合物，用于上述权利要求中所规定的用途。
10.一种方法，所述方法包括调节软骨形成祖细胞例如间充质干细胞中的ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性，例如增加ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性以促进软骨形成祖细胞例如间充质干细胞的软骨发生，或者下调ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性以减少软骨形成祖细胞例如间充质干细胞的软骨发生。
11.一种促进软骨、骨或韧带修复或者诱导软骨组织的修复或再生的方法，所述方法包括增加软骨形成祖细胞例如间充质干细胞中的ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。
12.权利要求1至5任一项的经工程改造的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞、权利要求6的细胞系、权利要求7的核酸、权利要求8的多肽或权利要求9的药物组合物用于治疗以下任一种病症的用途：软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病。
13.一种治疗个体的疾病的方法，所述疾病例如软骨组织的修复或再生；与软骨、骨或韧带缺损相关的疾病、损害、病症或损伤；创伤性损伤；年龄相关的退行性疾病；或者退行性关节病，所述方法包括上调所述个体中的或所述个体的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞中ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性，或者将表现出ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性增加的软骨形成祖细胞例如间充质干细胞给予需要这类治疗的个体。
14.ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物作为软骨形成祖细胞例如间充质干细胞的软骨形成分化的标记物的用途。
15.一种调节Sox9的表达或活性的方法，所述方法包括调节ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性。
16.一种鉴定能够使软骨形成祖细胞例如间充质干细胞能够进行软骨发生或者促进软骨细胞的软骨发生的试剂的方法，所述方法包括使ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物与候选试剂接触并确定所述候选试剂是否与ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物结合，并且任选地确定ZNF145或者其片段、同源物、变体或衍生物的表达或活性是否因此受到调节。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004711A (zh) * 2014-06-13 2014-08-27 哈尔滨工业大学 一种提高人间充质干细胞分化能力的方法
CN105039247A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
CN105693822A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 王宏田 一种促进软骨组织修复的多肽、多肽衍生物
CN107075477A (zh) * 2014-09-19 2017-08-18 再生医疗服务私人有限公司 通过用于植入的离体成骨细胞培养诱导骨形成的方法
CN107340277A (zh) * 2017-06-06 2017-11-10 华东师范大学 一种dna银纳米簇及其细胞原位的合成方法和应用
CN109355262A (zh) * 2018-06-13 2019-02-19 浙江生创精准医疗科技有限公司 永生化宫血干细胞系
CN109731095A (zh) * 2019-03-14 2019-05-10 广东龙帆生物科技有限公司 一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物及制备方法和应用
CN110998277A (zh) * 2017-06-07 2020-04-10 阿里·埃蒂尔克 用于标记、透明化和成像大型组织的方法
CN116904520A (zh) * 2023-09-13 2023-10-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2832851B1 (en) * 2012-03-28 2019-04-17 Quarrymen & Co. Inc. Immortalized stem cells and medicinal composition and medicinal preparation comprising product thereof as active ingredient
JP6588005B2 (ja) * 2013-03-15 2019-10-09 アンピオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 軟骨形成を刺激するために使用される医薬組成物
KR20160102069A (ko) * 2013-12-27 2016-08-26 텔로리젠, 인크. 생체내에서 세포에 활성 텔로머라제를 제공하기 위한 조성물 및 방법
CN104630214B (zh) * 2015-01-20 2017-02-22 胡松 Sry基因引物对与探针的组合和sry多位点检测试剂盒
CN105695402A (zh) * 2016-04-14 2016-06-22 安沂华 诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法
EP3821032A1 (en) * 2018-07-13 2021-05-19 HiFiBiO SAS Use of droplet single cell epigenome profiling for patient stratification

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1427009A (zh) * 2002-11-12 2003-07-02 湖南师范大学 一个人类锌指蛋白家族新基因znf325

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8192988B2 (en) * 2004-10-22 2012-06-05 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods for increasing potency of adult mesenchymal stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1427009A (zh) * 2002-11-12 2003-07-02 湖南师范大学 一个人类锌指蛋白家族新基因znf325

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN SJ ET AL: "Rearrangements of the retinoic acid receptor alpha and promyelocytic leukemia zinc finger genes resulting from t(11;17)q(23;q21) in a patient with acute promyelocytic leukemia", 《J.CLIM.INVEST》 *
CHEN Z ET AL: "NM_006006.4", 《GENBANK》 *
IKEDA R ET AL: "NM_001018011", 《GENBANK》 *
IKEDA R ET AL: "The promyelotic leukemia zinc finger promotes osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells as an upstream regulator of CBFA1", 《J BIOL CHEM》 *
TONGMING LIU ET AL: "Identification of common pathways mediating differentiation of bone marrow- and adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells into three mesenchymal lineages", 《STEM CELLS》 *
ZHIHUI TANG ET AL: "Overexpression of the ZIP1 zinc transporter induces an osteogenic phenotype in mesenchymal stem cells", 《BONE》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004711B (zh) * 2014-06-13 2016-08-24 哈尔滨工业大学 一种提高人间充质干细胞向成骨分化能力的方法
CN104004711A (zh) * 2014-06-13 2014-08-27 哈尔滨工业大学 一种提高人间充质干细胞分化能力的方法
CN107075477A (zh) * 2014-09-19 2017-08-18 再生医疗服务私人有限公司 通过用于植入的离体成骨细胞培养诱导骨形成的方法
CN105039247B (zh) * 2015-07-13 2018-07-20 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
CN105039247A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
CN105693822A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 王宏田 一种促进软骨组织修复的多肽、多肽衍生物
CN107340277A (zh) * 2017-06-06 2017-11-10 华东师范大学 一种dna银纳米簇及其细胞原位的合成方法和应用
CN107340277B (zh) * 2017-06-06 2020-02-18 华东师范大学 一种dna银纳米簇及其细胞原位的合成方法和应用
CN110998277A (zh) * 2017-06-07 2020-04-10 阿里·埃蒂尔克 用于标记、透明化和成像大型组织的方法
CN109355262A (zh) * 2018-06-13 2019-02-19 浙江生创精准医疗科技有限公司 永生化宫血干细胞系
CN109731095A (zh) * 2019-03-14 2019-05-10 广东龙帆生物科技有限公司 一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物及制备方法和应用
CN116904520A (zh) * 2023-09-13 2023-10-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用
CN116904520B (zh) * 2023-09-13 2024-01-09 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用

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