CN103179984A - 用于递送免疫原编码rna的peg化脂质体 - Google Patents

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Abstract

核酸免疫通过递送包封在脂质体内的RNA来完成。所述RNA编码感兴趣免疫原。聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa。因此，本发明提供具有包封水性核心的脂双层的脂质体，其中：(i)所述脂双层包括含聚乙二醇部分的至少一种脂质，从而聚乙二醇在脂质体外部出现，其中聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa；和(ii)水性核心包括编码免疫原的RNA。这些脂质体适于递送RNA到脊椎动物细胞并因此其用作药物组合物成分以针对多种疾病免疫对象。

Description

用于递送免疫原编码RNA的PEG化脂质体
本申请要求2010年8月31日提交的美国临时申请号61/378,826的权益，其完整内容在此通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明处于用于免疫的RNA非病毒递送领域。
背景技术
数年来用于免疫的核酸递送已成为目标。测试了多种方法，包括使用DNA或RNA、病毒或非病毒递送载剂(或甚至没有递送载剂，在“裸露”疫苗中)、复制或非复制载体、病毒或非病毒载体。
仍需要进步和改善的核酸疫苗，且特别是递送核酸疫苗的改善方法。
发明内容
根据本发明，通过递送包封在脂质体内的RNA来完成核酸免疫。RNA编码感兴趣的免疫原。脂质体包括PEG化脂质，即所述脂质通过共价结合聚乙二醇来修饰。PEG提供的脂质体有能赋予有利药代动力学特征的包被，例如其能增加脂质体的稳定性和防止非特异性吸收。发明者发现PEG长度能影响包封RNA的体内表达，因此本发明使用所含PEG平均分子量为1kDa-3kDa的脂质体。分子量较低(如500或750Da)的PEG不形成稳定脂质体。
因此，本发明提供其内包封感兴趣免疫原的编码RNA的脂质体，其中所述脂质体包括含聚乙二醇部分的至少一种脂质，从而聚乙二醇在脂质体外部出现，其中聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa。这些脂质体适于体内递送RNA到脊椎动物细胞，因此其用作药物组合物组分以针对多种疾病免疫对象。
本发明还提供制备含RNA的脂质体的方法，包含混合RNA与一种或多种脂质的步骤，所处条件使脂质形成其内包封RNA的脂质体，其中至少一种脂质包括在所述方法中位于脂质体外部的聚乙二醇部分，其中聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa。
脂质体
本发明使用其内包封免疫原编码RNA的脂质体。因此，RNA(如天然病毒中)与任何外部介质分开。发现脂质体内的包封保护RNA免于RNA酶消化。所述脂质体能包括一些外部RNA(如在其表面上)，但至少一半RNA(理想上为全部)在脂质体核心中包封。脂质体内的包封不同于例如参考文献1所公开的脂质/RNA复合物，其中RNA混合预形成的脂质体。
多种两性脂质能在水亲性环境中形成双层以包封含RNA的水性核心作为脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头部基团。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到1960年代，自1990年代开始研究形成阳离子脂质体的脂质。一些磷脂为阴离子而另一些为两性离子且另一些为阳离子。合适磷脂类型包括但不限于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂列于表1。有用的阳离子脂质包括但不限于二油酰基三甲氨基丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1，2-二油氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1，2-二亚油氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质包括但不限于酰基两性离子脂质和醚两性离子脂质。有用的两性离子脂质示例是DPPC、DOPC、DSPC、十二烷基磷酸胆碱、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、和1，2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。所述脂质可以是饱和或不饱和的。优选使用至少一种不饱和脂质以制备脂质体。如果不饱和脂质有2个尾，2个尾都可为不饱和，或其能具有1个饱和尾和1个不饱和尾。脂质能包括1个尾如RV05中的类固醇基团。
因此，在一个实施方式中，本发明提供具有包封水性核心的脂双层的脂质体，其中：(i)所述脂双层包括含聚乙二醇部分的至少一种脂质，从而聚乙二醇在脂质体外部出现，其中聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa；和(ii)水性核心包括编码免疫原的RNA。
本发明的脂质体能从单一脂质或脂质混合物中形成。混合物可包含(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性离子脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质的混合物(v)阴离子脂质和两性离子脂质的混合物(vi)两性离子脂质和阳离子脂质的混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质的混合物。类似地，混合物可包含饱和及不饱和脂质。例如，混合物可包含DSPC(两性离子，饱和)、DlinDMA(阳离子，不饱和)、和/或DMG(阴离子，饱和)。使用脂质混合物时，所述混合物中不是所有组成脂质需为两性，如种或多种两性脂质能与胆固醇混合。
发明的脂质体从脂质混合物中形成时，优选如本文所述PEG化的那些脂质比例小于10％的总脂质量，如0.5-5％、1-4％、或约2％。例如，下面显示有用的脂质体，其中2％的总脂质为PEG-DMG。剩余物能由例如胆固醇(如35-50％胆固醇)和/或阳离子脂质(如30-70％)和/或DSPC(如5-15％)构成。这种混合物在下面使用。这些百分比值是摩尔百分数。
因此，脂质体能从阳离子脂质(如DlinDMA、RV05)、两性离子脂质(如DSPC、DPyPE)、胆固醇和PEG化脂质中形成。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物以及数种其他混合物用于示例。
脂质体内的至少一种脂质包括聚乙二醇部分。包括这些PEG化脂质的脂质体会具有PEG定向，从而其在至少脂质体外部出现(但一些PEG还可暴露于脂质体内部，即水性核心)。此定向可通过连接PEG与合适脂质部分来完成。例如，两性脂质中的PEG会结合亲水头部，因为所述头部本身定向脂双层面向水的外部。此方法中的PEG化可通过共价结合PEG与脂质来完成，如使用参考文献2和3公开的那些技术。
因此，PEG化脂质包含PEG结构：
Figure BDA00003110182800031
其中n提供分子量1kDa-3kDa的PEG，如23-68，或就2kDa PEG化提供约45(例如参见图16)。
PEG部分能终止于-O-甲基，因此PEG化脂质可包含：
因此，包括结合脂质头部基团的氮，本发明使用的PEG化脂质可包含：
Figure BDA00003110182800033
用于本发明的一种合适PEG化脂质是PEG-DMG，如示例所用。图17A-17E显示其他有用的PEG化脂质。还能使用PEG化胆固醇。能使用其他PEG化脂质，如具有式(X)的脂质：
Figure BDA00003110182800041
其中：
Z是亲水头部基团，选自PEG和基于聚唑啉、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚甘油、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚氨基酸的聚合物，其中所述聚合物可为线性或分支，其中所述聚合物可选取代；
Z由n个亚基聚合；
n是10-200单位Z的数均聚合度(且能就不同Z基团优化)；
L1是可选取代的C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基接头，包括0、1或2个醚(如-O-)、酯(如-C(O)O-)、琥珀酸盐(如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、氨基甲酸酯(如-OC(O)-NR′-)、碳酸盐(如-OC(O)O-)、尿素(如-NRC(O)NR′-)、胺(如-NR′-)、酰胺(如-C(O)NR′-)、亚胺(如-C(NR′)-)、硫醚(如-S-)、黄酸盐(如-OC(S)S-)、和磷酸二酯(如-OP(O)2O-)，其中R′独立选自-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸或可选取代的C1-10亚烷基。
X1和X2独立选自碳或杂原子，所述杂原子选自-NH-、-O-、-S-、或磷酸。
A1和A2独立选自C6-30烷基、C6-30烯基、和C6-30炔基，其中A1和A2可相同或不同，或A1和A2以及其结合的碳原子形成可选取代的类固醇。
本发明的脂质体通常包括大量相同或不同的PEG部分。本发明脂质体中PEG的平均分子量为1kDa-3kDa，如1.5-2.5kDa、1.7-2.3kDa、1.8-2.2kDa、1.9-2.1kDa、或2kDa。因此，PEG可以是通常称为“PEG 2000”或“PEG 2k”的PEG，尽管还能使用更短的“PEG 1000”和更长的“PEG 3000”。
PEG通常包含线性聚合物链，但在一些实施方式中，PEG可包含分支聚合物链。
就单个脂质分子而言还能包括一个以上PEG基团，如结合脂质头部基团中的不同碳原子(例如参见图18)。这些情况下，提及脂质体中PEG的分子量是每脂质分子的分子量，而不是每PEG取代基。因此，在唯一PEG化脂质具有图18所示结构的脂质体中，其中加框分子量为2kDa且各由2条1kDa链构成，PEG的平均分子量为2kDa，而不是1kDa。
在一些实施方式中，PEG可以是取代的PEG，如其中聚合物内的一个或多个碳原子由个或多个烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。
在一些实施方式中，PEG可包括共聚物基团如一个或多个丙烯单体，以形成PEG聚丙烯聚合物。
作为PEG化的替代，脂质可通过共价结合不同于PEG的部分来修饰。例如，在一些实施方式中，脂质可包括聚磷腈。在一些实施方式中，脂质可包括聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方式中，脂质可包括聚丙烯酰胺。在一些实施方式中，脂质可包括聚(2-甲基-2-唑啉)。在一些实施方式中，脂质可包括聚(2-乙基-2-
Figure BDA00003110182800052
唑啉)。在一些实施方式中，脂质可包括磷脂酰聚甘油。在一些实施方式中，脂质可包括聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。在一些实施方式中，脂质可包括PEG以外的聚亚烷基醚聚合物。
脂质体通常分成3组：多层囊泡(MLV)；单层小囊泡(SUV)；和单层大囊泡(LUV)。MLV具有各囊泡中的多个双层，形成数个分开的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的单一双层；SUV通常直径≤50nm，LUV直径＞50nm。本发明的脂质体理想地是直径范围为60-180nm的LUV，优选80-160nm范围。
本发明的脂质体可以是含多个脂质体的组合物一部分。所述集合内的脂质体可具有一定范围的直径。对于含不同直径脂质体群的组合物：(i)至少80％数量的脂质体应具有60-180nm范围的直径，优选80-160nm范围，和/或(ii)群平均直径(通过强度，如Z-均)理想地为60-180nm范围，优选80-160nm范围。所述集合内的直径应理想上具有＜02的多分散指数。预期参考文献1的脂质体/RNA复合物具有600-800nm范围直径且有较高的多分散性。
制备合适脂质体的技术为本领域熟知，如参见参考文献4-6。一种有用的方法描述于参考文献7且涉及混合(i)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液和(iii)缓冲液，然后混合、平衡、稀释和纯化。本发明的优选脂质体通过此混合方法可获得。
为获得有所需直径的脂质体，混合能用某一方法进行，所述方法中RNA水溶液的2股进料流在单一混合区中与1股乙醇脂质溶液流合并，都采用相同流速，如在下述的微流通道中。
RNA
本发明的脂质体包括编码免疫原的RNA分子(不同于参考文献2中的siRNA)。体内给予颗粒后，RNA从颗粒中释放并在细胞内翻译以原位提供免疫原。
RNA是+-链，因此其能由细胞翻译而不需任何干预复制步骤如反转录。其还能结合免疫细胞表达的TLR7受体，从而启动佐剂效应。
优选的+-链RNA自身复制。自复制RNA分子(复制子)递送给脊椎动物细胞(甚至没有任何蛋白)时能通过自身转录(经其自身产生的反义拷贝)引起多个子RNA生成。因此，自复制RNA分子通常是递送给细胞后能直接翻译的+-链分子，此翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，其随后从已递送RNA中生成反义和有义转录本。因此，已递送RNA引起多个子RNA生成。这些子RNA以及共线亚基因组转录本可自身翻译提供编码免疫原的原位表达，或可转录以提供与已递送RNA同义的其他转录本，所述转录本经翻译提供所述免疫原的原位表达。此序列转录的总结果是数量上大副扩增所引入复制子RNA且因此编码免疫原成为细胞的主要多肽产物。
实现自复制的一个合适系统是使用基于甲病毒的RNA复制子。这些+链复制子在递送给细胞后翻译以产生复制酶(或复制酶-转录酶)。复制酶翻译成自动切割提供复制复合体的多聚蛋白，所述复合体产生+-链递送RNA的基因组-链拷贝。这些-链转录本能自身转录产生+-链亲本RNA的其他拷贝并还产生编码免疫原的亚基因组转录本。因此，翻译亚基因组转录本引起感染细胞原位表达免疫原。合适的甲病毒复制子能使用来自辛德毕斯病毒、姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。能使用突变或野生型病毒序列，如VEEV的减毒TC83突变体已用于复制子[8]。
因此，优选的自复制RNA分子编码(i)从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是甲病毒复制酶，如包含一种或多种甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。
天然甲病毒基因组编码除了非结构复制酶多聚蛋白以外的结构毒粒蛋白，优选本发明的自复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，优选的自复制RNA能引起细胞中生成自身的基因组RNA拷贝，但不生成含RNA的病毒粒子。不能生成这些病毒粒子意味着不同于野生型甲病毒，自复制RNA分子不能自身保持感染形式。就野生型病毒中保持而言必需的甲病毒结构蛋白在本发明自复制RNA中缺失且其位置由编码感兴趣免疫原的基因取代，从而亚基因组转录本编码免疫原而不是结构甲病毒毒粒蛋白。
因此，本发明使用的自复制RNA分子可具有2个开放阅读框。第(5′)开放阅读框编码复制酶；第二(3′)开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外(如下游)开放阅读框，如编码其他免疫原(见下)或编码辅助多肽。
自复制RNA分子能具有与所编码复制酶相容的5′序列。
自复制RNA分子能有多种长度，但其通常长5000-25000个核苷酸，如8000-15000个核苷酸，或9000-12000个核苷酸。因此，所述RNA比siRNA递送中所见更长。
本发明使用的RNA分子可具有5′帽(如7-甲基鸟苷)。此帽能增强体内RNA翻译。
本发明使用的RNA分子5′核苷酸可具有5′三磷酸基团。其在加帽RNA中可经5′-5′桥连接7-甲基鸟苷。5′三磷酸能提高RIG-I结合并因而促进佐剂效应。
RNA分子可具有3′聚A尾。其还可在3′末端附近包括聚A聚合酶识别序列(如AAUAAA)。
本发明使用的RNA分子通常为单链。单链RNA一般能通过结合TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR来启动佐剂效应。以双链形式(dsRNA)递送的RNA能结合TLR3，此受体还能由单链RNA复制中或单链RNA二级结构内形成的dsRNA引起。
本发明使用的RNA分子能通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT能使用以质粒形式在细菌中产生和增殖的模板，或合成产生(例如通过合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程改造方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶)能用于从DNA模板转录RNA。合适的加帽和聚A加成反应可根据需要使用(尽管复制子的聚A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶对转录的5′核苷酸可具有严格要求且在一些实施方式中，这些要求必须与所编码复制酶的要求相匹配，以确保IVT-转录RNA能就自编码复制酶而言有效发挥底物功能。
如参考文献9所讨论，自复制RNA能包括(除了任何5′帽结构外)一个或多个有修饰核碱基的核苷酸。因此，RNA可保包含m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿苷)，Um(2′-O-甲基腺苷)、m1A(1-甲基腺苷);m2A(2-甲基腺苷);Am(2′-O-甲基腺苷);ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷);i6A(N6-异戊烯腺苷);ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯腺苷)；io6A(N6-(顺-羟异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺-羟异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨甲酰腺苷))；t6A(N6-苏氨酰氨甲酰腺苷);ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷);hn6A(N6-羟正缬氨酰氨甲酰腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟正缬氨酰氨甲酰腺苷)；Ar(p)(2′-O-腺嘌呤核糖苷(磷酸))；I(肌苷)；m11(1-甲基肌苷);m′Im(1，2′-O-二甲基肌苷);m3C(3-甲基胞苷);Cm(2T-O-甲基胞苷)；s2C(2-巯基胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-fonnylcytidine)；m5Cm(5，2-O-二甲基胞苷);ac4Cm(N4乙酰基2TO甲基胞苷);k2C(赖西丁);mlG(1-甲基鸟苷);m2G(N2-甲基鸟苷);m7G(7-甲基鸟苷);Gm(2′-O-甲基鸟苷);m22G(N2，N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2，2′-O-二甲基鸟苷)；m22Gm(N2，N2，2′-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2′-O-核糖鸟核苷(磷酸))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基鸟苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖-辫苷)；preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQi(7-氨甲基-7-脱氮鸟苷)；G*(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5，2′-O-二甲基尿苷);s4U(4-硫尿苷);m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷);s2Um(2-硫代-2′-O-甲基尿苷);acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-酸乙酸);mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯);chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷));mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧羰基甲基尿苷);mcm5Um(S-甲氧羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U(5-氨甲基-2-硫尿苷);mnm5U(5-甲氨基甲基尿苷);mnm5s2U(5-甲氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲氨基甲基-2-硒尿苷);ncm5U(5-氨甲酰甲基尿苷);ncm5Um(5-氨甲酰甲基-2′-O-甲基尿苷);cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷))；cnmm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2-L-O-甲基尿苷);cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷));m62A(N6，N6-二甲基腺苷);Tm(2′-O-甲基肌苷);m4C(N4-甲基胞苷);m4Cm(N4，2-O-二甲基胞苷);hm5C(5-羟甲基胞苷);m3U(3-甲基尿苷);cm5U(5-羧甲基尿苷);m6Am(N6，T-O-二甲基腺苷)；rn62Am(N6，N6，O-2-三甲基腺苷)，m2′7G(N2，7-二甲基鸟苷)；m2′2′7G(N2，N2，7-三甲基鸟苷);m3Um(3，2T-O-二甲基尿苷);m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰-2′-O-甲基胞苷);mlGm(1，2′-O-二甲基鸟苷);m′Am(1，2-O-二甲基腺苷)伊立甲基尿苷(irinomethyluridine));tm5s2U(S-taurinomethyl-2-硫尿苷));imG-14(4-去甲基鸟苷);imG2(异鸟苷);或ac6A(N6-乙酰基腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧-腺嘌呤、其7-取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、8-氧桥鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-取代嘌呤、7-脱氮-8-取代嘌呤、或脱碱基核苷酸。例如，自复制RNA能包括一个或多个经修饰嘧啶核碱基，如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。然而，在一些实施方式中，RNA不包括经修饰核碱基，且可不包括经修饰核苷酸，即RNA中的所有核苷酸是标准A、C、G和U核糖核苷酸(除了任意5′帽结构，其可包括7′-甲基鸟苷)。在其他实施方式中，RNA可包括含7′-甲基鸟苷的5′帽，前1、2或3个5′核糖核苷酸可在核糖2′位置甲基化。
本发明使用的RNA理想上仅包括核苷间磷酸二酯键，但在一些实施方式中，其能包含磷酰胺酯、硫代磷酸、和/或甲基膦酸酯键。
脂质体理想地包括少于10个不同RNA种类，如5、4、3、或2个不同种类；脂质体最优选包括单一RNA种类，即脂质体中的所有RNA分子具有相同序列和相同长度。
每脂质体的RNA量可变化。每脂质体的单独自复制RNA分子数通常为每脂质体≤50，如＜20、＜10、＜5或1-4。
免疫原
本发明使用的RNA分子编码多肽免疫原。给予脂质体后，RNA进行体内翻译且免疫原能引起受体中的免疫应答。免疫原可引起针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的免疫应答(或在一些实施方式中，针对过敏原；和在其他实施方式中，针对肿瘤抗原)。免疫应答可包含抗体反应(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫应答。多肽免疫原通常引起识别对应细菌、病毒、真菌或寄生虫(或过敏原或肿瘤)多肽的免疫应答，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位引起识别细菌、病毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。免疫原一般是表面多肽如粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、纤突蛋白等。
RNA分子能编码单个多肽免疫原或多个多肽。多个免疫原可表现为单个多肽免疫原(融合多肽)或分开的多肽。如果免疫原从复制子中表达为单独多肽，则可为这些中的一个或多个提供上游IRES或额外病毒启动子元件。或者，多个免疫原可从编码个体免疫原的多聚蛋白中表达，所述蛋白融合较短自催化蛋白酶(如口蹄疫病毒2A蛋白)，或表达为内含肽类。
不同于参考文献1和10，所述RNA编码免疫原。为避免疑义，本发明不涵盖编码萤火虫荧光素酶或编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶融合蛋白或编码绿色荧光蛋白(GFP)的RNA。这种多肽可用作标记，或甚至在基因治疗背景下，但本发明涉及递送RNA以引发免疫应答系统。因此，免疫原不是递送用于补充或取代缺陷型宿主蛋白的自身蛋白(如基因治疗中)。同样，所述RNA不是小鼠胸腺总RNA。
在一些实施方式中，所述免疫原引起针对这些细菌之一的免疫应答：
脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)：有用的免疫原包括但不限于膜蛋白如粘附素、自转运蛋白、毒素、摄铁蛋白、因子H结合蛋白。3种有用多肽的组合公开于参考文献11。
肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)：有用的免疫原公开于参考文献12。这些包括但不限于RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰-氨基己糖苷酶前体(spr0057)、spr0096、一般应激蛋白GSP-781(spr2021，SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)、和肺炎球菌表面粘附素PsaA。
酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)：有用的免疫原包括但不限于参考文献13和14公开的多肽。
卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。
百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)：有用的免疫原包括但不限于百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素、凝集原2和3。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：有用的免疫原包括但不限于参考文献15公开的多肽，如溶血素、esxA、esxB、铁色素结合蛋白(sta006)和/或sta011脂蛋白。
破伤风梭菌(Clostridium tetani)：典型免疫原是破伤风类毒素。
白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)：典型免疫原是白喉类毒素。
流感嗜血杆菌(Haemophilus inflienzae)：有用的免疫原包括但不限于参考文献16和17公开的多肽。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)：有用的免疫原包括但不限于参考文献13公开的多肽。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：有用的免疫原包括但不限于PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH-样、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG(如参考文献18所公开)。LcrE[19]和HtrA[20]是2种优选的免疫原。
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：有用的免疫原包括但不限于参考文献21公开的多肽。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：有用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP、和/或脲酶[22]。
大肠杆菌(Escherichia coli)：有用的免疫原包括但不限于从产肠毒素性大肠杆菌(E.coli)(ETEC)、肠集聚性大肠杆菌(EAggEC)、散漫粘附性大肠杆菌(DAEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)衍生的免疫原。ExPEC菌株包括致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症相关大肠杆菌(MNEC)。有用的UPEC多肽免疫原公开于参考文献23和24。有用的MNEC免疫原公开于参考文献25。数种大肠杆菌类型的有用免疫原是AcfD[26]。
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)：有用的免疫原包括但不限于参考文献27和28公开的那些。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或肉毒杆菌(Clostridium botulinums)
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)
布鲁氏菌(Brucella)，如流产布鲁氏菌(B.abortus)、犬布鲁氏菌(B.canis)、羊布鲁氏菌(B.melitensis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)、羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)、鳍脚类布鲁氏菌(B.pinnipediae)。
弗朗西斯菌(Francisella)，如新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)、蜃楼弗朗西斯菌(F.philomiragia)、上拉弗朗西斯菌(F.tularensis)。
淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)
梅毒螺旋体(Treponema pallidum)
杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)
腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)
结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
立克次氏体(Rickettsia)
单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)
伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)
克雷白氏杆菌(Klebsiella)
在一些实施方式中，所述免疫原引起针对这些细菌之一的免疫应答：
正粘病毒(Orthomyxovirus)：有用的免疫原能是A、B或C型流感病毒，如血凝素、神经氨酸苷酶或基质M2蛋白。所述免疫原是A型流感病毒血凝素时，其可来自任何亚型，如H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H13，H14，H15或H16。
副粘液病毒科(Paramyxoviridae)病毒：病毒免疫原包括但不限于从肺病毒(如呼吸道合胞体病毒，RSV)、腮腺炎病毒(如流行性腮腺炎病毒)、副粘液病毒(如副流感病毒)、变型肺病毒和麻疹病毒(如疹病毒)衍生的那些。
痘病毒科(Poxviridae)：病毒免疫原包括但不限于从正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)衍生的那些，所述天花包括但不限于大天花(Variola major)和小天花(Variola minor)。
小核糖核酸病毒(Picornavirus)：病毒免疫原包括但不限于从细小核糖核酸病毒衍生的那些，所述细小核糖核酸病毒如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口疮病毒。在一个实施方式中，所述肠病毒是脊髓灰质炎病毒，如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。在另一个实施方式中，所述肠病毒是柯萨奇病毒A或B。
布尼亚病毒(Bunyavirus)：病毒免疫原包括但不限于从正布尼病毒(Orthobunyavirus)衍生的那些，所述正布尼病毒例如加州脑炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷热病毒、或内罗病毒(Nairovirus)如里米亚-刚果出血热病毒。
嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒免疫原包括但不限于从嗜肝RNA病毒如甲肝病毒(HAV)衍生的那些。
线状病毒(Filovirus)：病毒免疫原包括但不限于从线状病毒衍生的那些，所述线状病毒如埃博拉病毒(包括扎伊尔、象牙海岸、雷斯顿或苏丹埃博拉病毒)或马尔堡病毒。
披膜病毒(Togavirus)：病毒免疫原包括但不限于从披膜病毒衍生的那些，所述披膜病毒如风疹病毒、甲病毒、或动脉炎病毒。这包括风疹病毒。
黄病毒(Flavivirus)：病毒免疫原包括但不限于从黄病毒衍生的那些，所述黄病毒如蜱媒脑炎(TBE)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒。
瘟病毒(Pestivirus)：病毒免疫原包括但不限于从瘟病毒衍生的那些，所述瘟病毒如牛病毒性腹泻(BVDV)、经典猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)。
嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒免疫原包括但不限于从嗜肝DNA病毒如乙肝病毒衍生的那些。组合物能包括乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。
其他肝炎病毒：组合物能包括来自丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒(HEV)、或庚肝病毒的免疫原。
弹状病毒(Rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不限于从弹状病毒如如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)衍生的那些。
杯状病毒(Caliciviridae)：病毒免疫原包括但不限于从杯状病毒衍生的那些，所述杯状病毒如诺沃克病毒(诺如病毒)和诺沃克样病毒，例如夏威夷病毒和雪山病毒。
冠状病毒(Coronavirus)：病毒免疫原包括但不限于从SARS冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)衍生的那些。
逆转录病毒(Retrovirus)：病毒免疫原包括但不限于从肿瘤病毒、慢病毒(如HIV-1或HIV-2)或泡沫病毒衍生的那些。
呼吸道肠道病毒(Reovirus)：病毒免疫原包括但不限于从正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒、或科罗拉多壁虱热病毒衍生的那些。
细小病毒(Parvovirus)：病毒免疫原包括但不限于从细小病毒B19衍生的那些。
疱疹病毒(Herpesvirus)：病毒免疫原包括但不限于从人疱疹病毒衍生的那些，所述疱疹病毒仅举例来说如单纯疱疹病毒(HSV)(如1和2型HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)、和人疱疹病毒8(HHV8)。
乳头状多瘤空泡病毒(Papovaviruses)：病毒免疫原包括但小限于从乳头瘤病毒和多瘤病毒衍生的那些。(人)乳头瘤病毒可具有血清型1，2，4，5，6，8，11，13，16，18，31，33，35，39，41，42，47，51，57，58，63或65，例如来自血清型6、11、16和/或18的一种或多种。
腺病毒(Adenovirus)：病毒免疫原包括但不限于从腺病毒血清型36(Ad-36)衍生的那些。
在一些实施方式中，所述免疫原引起针对感染鱼的病毒的免疫应答，如：传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)，鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、斑点叉尾鯝病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA样病毒(又称为大西洋鲑鱼小RNA样病毒)、陆封鲑鱼病毒(LSV)、大西洋鲑鱼轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑鱼肿瘤病毒(CSTV)、或鱼病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。
真菌免疫原可获自皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，(Trichophytonmegnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白变种、盘状变种、赭黄变种，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillusydowi)、黄曲菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichumclavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、肠间隔微孢子虫(Septata intestinalis)和毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的是短粒虫属(Brachiolaspp.)、微胞子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pttyrosporumovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium mameffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaea spp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Hehninthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核盘菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.)。
在一些实施方式中，所述免疫原引起针对来自疟原虫(Plasmodium)属的寄生虫的免疫应答，如
Figure BDA00003110182800161
性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)或卵圆疟原虫(P.ovale)。因此，本发明可用于针对疟疾免疫。在一些实施方式中，所述免疫原引起针对来自鱼虱(Caligidae)科的寄生虫的免疫应答，特别是来自疮痂鱼虱属(Lepeophtheirus)和和鱼虱(Caligus)属的那些，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。
在一些实施方式中，所述免疫原引起针对以下的免疫应答：花粉过敏原(树、草本、杂草和草花粉过敏原)；昆虫或蜘蛛过敏原(吸入、唾液和毒液过敏原如螨虫过敏原、蟑螂和蠓过敏原、膜翅目昆虫毒液过敏原)；动物毛发和头皮屑过敏原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；和食物过敏原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉过敏原源自分类目壳斗目，木犀目，松杉目和悬铃木目，包括但不限于包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，雪松(柳杉属和圆柏属)，悬铃木(法国梧桐)，禾本目包括黑麦属、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和墙草属。其他重要的吸入过敏原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨的那些，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液过敏原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、黄蜂(胡蜂科(Vespidea))和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。
在一些实施方式中，所述免疫原是选自以下的肿瘤抗原：(a)睾丸癌抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，例如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(能用于例如针对黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)；(b)突变抗原，例如p53(与多种实体瘤相关，如结直肠癌、肺癌和头颈癌)、p21/Ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关)、CDK4(与例如黑色素瘤相关)、MUM1(与例如黑色素瘤相关)、胱冬酶-8(与例如头颈癌相关)、CIA0205(与例如膀胱癌相关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(与例如黑色素瘤相关)、TCR(与例如T细胞非霍奇金淋巴瘤相关)、BCR-abl(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、KIA0205、CDC-27、和LDLR-FUT；(c)过表达抗原，例如半乳糖凝集素4(与例如结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(与例如霍奇金病有关)、蛋白酶3(与例如慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(与例如多种白血病有关)、碳酸酐酶(与例如肾癌有关)、醛缩酶A(与例如肺癌有关)、PRAME(与例如黑色素瘤有关)、HER-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白(与例如肝细胞癌有关)、KSA(与例如结直肠癌有关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(与例如乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(与例如肾细胞癌有关)、p53(与例如乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)；(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与例如黑色素瘤有关)；(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，与例如前列腺癌相关；(f)免疫球蛋白独特型(例如与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤相关)。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA2729\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
药物组合物
本发明的脂质体用作药物组合物成分以针对多种疾病免疫对象。除了脂质体以外，这些组合物通常包括药学上可接受的运载体。关于药学上可接受运载体的充分讨论参见参考文献29。
本发明的药物组合物可包括一种或多种小分子免疫增强剂。例如，所述组合物可包括TLR2激动剂(如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(如氨烷基磷酸氨基葡糖苷，如E6020)、TLR7激动剂(如咪喹莫特)、TLR8激动剂(如瑞喹莫德)和/或TLR9激动剂(如IC31)。任何这类激动剂的分子量＜2000Da。在一些实施方式中，这种激动剂在脂质体内用RNA包封，但在其他实施方式中，其未包封。
本发明的药物组合物可包括溶于淡水(如w.f.i)或缓冲液的脂质体，所述缓冲液如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲液盐通常以5-20mM范围包括在内。
本发明的药物组合物可具有5.0-9.5的pH，如6.0-8.0。
本发明的组合物可包括钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10+2mg/ml，如约9mg/ml。
本发明的组合物可包括金属离子螯合剂。这些能通过移出可加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA稳定性。因此，组合物可包括一种或多种EDTA、EGTA、BAPTA、钆喷酸等。这种螯合剂通常以10-500μM如0.1mM存在。柠檬酸盐如柠檬酸钠还能用作螯合剂，同时还有利地提供缓冲活性。
本发明的药物组合物可具有200mOsm/kg-400mOsm/kg的渗透压，如240-360mOsm/kg、或290-310mOsm/kg。
本发明的药物组合物可包括一种或多种防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，可优选不含防腐剂的疫苗。
本发明的药物组合物优选无菌。
本发明的药物组合物优选无热原，如含每剂量＜1EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量＜0.1EU。
本发明的药物组合物优选不含谷蛋白。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量可具有0.1-1.0ml的体积，如约0.5ml。
所述组合物可制备注射剂，如溶液或悬液。所述组合物可制备用于肺部给予，如通过吸入器，使用细雾。所述组合物可制备用于鼻、耳或眼部给予，如作为喷雾或滴剂。用于肌肉内给予的注射剂是典型的。
组合物包含免疫学有效量的脂质体以及根据需要的其他组分。“免疫学有效量”指将单剂量或一系列剂量一部分的量给予个体对于治疗或预防有效。此量根据待治疗个体健康和身体状况、年龄、待治疗个体分类组(如非人灵长类动物、人灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配制、治疗医师对医疗情况的评价、和其他相关因素而变化。预期所述量落在能通过常规试验确定的相对广泛范围内。本发明组合物的脂质体和RNA含量一般以每剂量的RNA量形式表示。优选的剂量具有≤100μg RNA(如10-100μg，如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)，但可在低许多的水平如≤1μg/剂、≤100ng/剂、≤10ng/剂、≤1ng/剂等观察到表达。
本发明还提供含有本发明药物组合物的递送装置(如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等)。此装置能用于将组合物给予脊椎动物对象。
本发明的脂质体不包含核糖体。
治疗和医学应用方法
与参考文献10所公开颗粒相反，本发明的脂质体和药物组合物用于体内应用以引起针对感兴趣免疫原的免疫应答。
本发明提供引起脊椎动物中免疫应答的方法，包含给予有效量的本发明脂质体或药物组合物的步骤。免疫应答优选为保护性且优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可引起加强反应。
本发明还提供发明的脂质体或药物组合物用于引起脊椎动物中免疫应答的方法。
本发明还提供发明的脂质体在生产引起脊椎动物免疫应答的药物中的应用。
通过这些应用和方法引起脊椎动物中的免疫应答，能保护脊椎动物免于多种疾病和/或感染如针对上述细菌和/或病毒性疾病。所述脂质体和组合物为免疫原性，且更优选是疫苗组合物。根据本发明的疫苗为预防性(即防止感染)或治疗性(即治疗感染)，但通常为预防性。
脊椎动物优选是哺乳动物，如人或大型哺乳动物(如马、牛、鹿、山羊、猪)。疫苗用于预防性应用时，人优选是儿童(幼儿或婴儿)或青少年；疫苗用于治疗性应用时，人优选是青少年或成年。用于儿童的疫苗还可给予成人，如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。
根据本发明的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者可以小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受所述疫苗的优选患者为老年人(如≥50岁，≥60岁并优选≥65岁)，年轻人(如≤5岁)，住院病人、保健护理人员、武装部队和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
本发明的组合物般直接给予患者。直接递送可通过胃肠外注射完成(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮内或组织间隙；不同于参考文献1，本发明一般不使用舌内注射)。替代性递送途径包括直肠、口腔(如片剂、喷雾)、颊、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其他粘膜给予。皮内和肌肉内给予是2种优选途径。注射可通过针(如皮下注射针)，但可替代性使用无针注射。典型肌肉内剂量为0.5ml。
本发明可用于引起全身和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身和/或粘膜免疫。
剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠外初次和粘膜加强、粘膜初次和胃肠外加强等给予各剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。在一个实施方式中，多个剂量可在出生后约6周、10周和14周给予，如在6周、10周和14周龄，如世界卫生组织扩大免疫规划(“EPI”)所用。在一个替代性实施方式中，2个初级剂量以约2个月间隔如约7、8或9周间隔给予，然后是第二初级剂量后约6个月-1年的一个或多个加强剂量，如第二初级剂量后约6、8、10或12个月。在另一个实施方式中，3个初级剂量以约2个月间隔如约7、8或9周间隔给予，然后是第三初级剂量后约6个月-1年的一个或多个加强剂量，如第三初级剂量后约6、8、10或12个月。
式(X)
式(X)的化合物包含连接脂质部分的亲水聚合物头部基团。其能描述为“隐形脂质(stealth lipids)”且具有式：
Figure BDA00003110182800201
其中：
Z是亲水头部基团，选自PEG和基于聚
Figure BDA00003110182800202
唑啉、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚甘油、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚氨基酸的聚合物，其中所述聚合物可为线性或分支，其中所述聚合物可选取代；
其中Z由n个亚基聚合；
n是10-200单位Z的数均聚合度，其中n就不同聚合物类型优化；
L1是可选取代的C1-10亚烷基或C1-10杂亚烷基接头，包括0、1或2个醚(如-O-)、酯(如-C(O)O-)、琥珀酸盐(如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、氨基甲酸酯(如-OC(O)-NR′-)、碳酸盐(如-OC(O)O-)、尿素(如-NRC(O)NR′-)、胺(如-NR′-)、酰胺(如-C(O)NR′-)、亚胺(如-C(NR′)-)、硫醚(如-S-)、黄酸盐(如-OC(S)S-)、和磷酸二酯(如-OP(O)2O-)，
其中R′独立选自-H、-NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸或可选取代的C1-10亚烷基；
X1和X2独立选自碳或杂原子，所述杂原子选自-NH-、-O-、-S-、或磷酸。
A1和A2独立选自C6-30烷基、C6-30烯基、和C6-30炔基，其中A1和A2可相同或不同，或A1和A2以及其结合的碳原子形成可选取代的类固醇。
在一个实施方式中，式(X)的化合物具有式(X′)
Figure BDA00003110182800211
其中
PEG是聚乙二醇亚基，其中PEG可为线性或分支；
n是10-200单位PEG的数均聚合度，优选约45单位；
L1是任选取代的C1-10杂亚烷基接头，包含1或2个醚、酯、琥珀酸盐、氨基甲酸酯、碳酸盐、尿素、胺、酰胺、亚胺、硫醚、黄酸盐、和磷酸二酯；
X1和X2是氧；
A1和A2独立选自C6-30烷基、C6-30烯基、和C6-30炔基，其中A1和A2可相同或不同，或其中A1和A2以及其结合的碳原子形成可选取代的类固醇。
式(X)和式(X′)的脂质用阳离子脂质配制形成脂质体时，能增加脂质体可体内存在(如血液中)的时间长度。其能遮蔽脂质体表面并因而减少血蛋白调理作用和巨噬细胞摄入。其他细节参见参考文献30和31。在一个实施方式中，所述脂质包含选自以下的基团：PEG(有时称为聚氧化乙烯)、基于聚
Figure BDA00003110182800212
唑啉、聚乙烯醇、聚甘油、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]和聚氨基酸的聚合物。
用于本发明的合适PEG化脂质包括聚乙二醇-二酰基甘油或聚乙二醇-二酰基咪唑双酰胺(PEG-DAG)偶联物，包括含二烷基甘油或二烷基咪唑双酰胺基团的那些，具有独立含约C4-约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度。二烷基甘油或二烷基咪唑双酰胺基团还能包含一个或多个取代的烷基。PEG化脂质能选自PEG-二月桂基甘油、PEG-二肉豆蔻甘油(来自NOF的产品目录号GM-020)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG--二月桂基咪唑双酰胺、PEG-二肉豆蔻咪唑双酰胺、PEG-二棕榈酰-咪唑双酰胺、和PEG-二硬脂基咪唑双酰胺、PEG-胆固醇(1-[8’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧)甲酰氨基-3’，6’-二氧辛基]氨甲酰-[Ω]-甲基-聚乙二醇、PEG-DMB(3，4-双十四氧基苄基(Ditetradecoxylbenzyl)-[Ω]-甲基-聚氧乙烯醚)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙氨醇-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](来自阿凡提脂质公司(Avanti Polar Lipids)的产品目录号880150P)。其他有用的PEG化脂质是S001，S002，S003，S004，S005，S006，S007，S008，S009，S010，S011和CS-020SA(NOF);S010和S011公开于参考文献32，分别标记为IVa和IVc。在参考文献32中，采用与本文所报道不同的合成以制备Iva和IVc。
化学术语和定义
卤代
术语“卤素”(或“卤代”)包括氟、氯、溴和碘。
烷基、亚烷基、烯基、炔基、环烷基等
术语“烷基”、“亚烷基”、“烯基”和“炔基”在本文中用于指直链和支链无环形式。其环状类似物称为环烷基等。
术语“烷基”包括单价、直链或支链、饱和、无环烃基基团。在一个实施方式中，烷基是C1-10烷基，在另一个实施方式中是C1-6烷基，在另一个实施方式中是C1-4烷基，如甲基、乙基、n-丙基、i-丙基或t-丁基。
术语“环烷基”包括单价、饱和、环烃基基团。在一个实施方式中，环烷基是C3-10环烷基，在另一个实施方式中是C3-6环烷基如环戊基和环己基。
术语“烷氧基”指烷基-O-。
术语“烯基”包括单价、直链或支链、不饱和、无环烃基基团，具有至少一个碳-碳双键，且在一个实施方式中没有碳-碳三键。在一个实施方式中，烯基是C2-10烯基，在另一个实施方式中是C2-6烯基，在另一个实施方式中是C2-4烯基。
术语“环烯基”包括单价、部分不饱和、环烃基基团，具有至少一个碳-碳双键，且在一个实施方式中没有碳-碳三键。在一个实施方式中，环烯基是C3-10环烯基，在另一个实施方式中是C5-10环烯基，如环己烯基或苯并环己基。
术语“炔基”包括单价、直链或支链、不饱和、无环烃基基团，具有至少一个碳-碳三键，且在一个实施方式中没有碳-碳双键。在个实施方式中，炔基是C2-10炔基，在另一个实施方式中是C2-6炔基，在另一个实施方式中是C2-4炔基。
术语“环炔基”包括单价、部分不饱和、环烃基基团，具有至少一个碳-碳三键，且在一个实施方式中没有碳-碳双键。在一个实施方式中，环炔基是C3-10环炔基，在另一个实施方式中是C5-10环炔基。
术语“亚烷基”包括二价、直链或支链、饱和、无环烃基基团。在一个实施方式中，亚烷基是C1-10亚烷基，在另一个实施方式中是C1-6亚烷基，在另一个实施方式中是C1-4亚烷基，如甲烯、乙烯、n-丙烯、i-丙烯或t-丙烯。
术语“亚烯基”包括二价、直链或支链、不饱和、无环烃基基团，具有至少一个碳-碳双键，且在一个实施方式中没有碳-碳三键。在一个实施方式中，亚烯基是C2-10亚烯基，在另一个实施方式中是C2-6亚烯基，在另一个实施方式中是C2-4亚烯基。
术语“亚炔基”包括二价、直链或支链、不饱和、无环烃基基团，具有至少一个碳-碳三键，且在一个实施方式中没有碳-碳双键。在一个实施方式中，亚炔基是C2-10a亚炔基，在另一个实施方式中是C2-6亚炔基，在另一个实施方式中是C2-4亚炔基。
杂烷基等
术语“杂烷基”包括烷基，其中多至6个碳原子、在一个实施方式中多至5个碳原子、在另一个实施方式中多至4个碳原子、在另一个实施方式中多至3个碳原子、在另一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且优选O、S(O)q或N)取代，只要保留至少一个烷基碳原子。杂烷基可以是C连接或杂连接，即其可经碳原子或经O、S(O)q、N、P(O)r或Si连接剩余分子。
术语“杂环烷基”包括环烷基，其中多至6个碳原子、在一个实施方式中多至5个碳原子、在另一个实施方式中多至4个碳原子、在另一个实施方式中多至3个碳原子、在另一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个环烷基碳原子。杂环烷基示例包括环氧乙基、硫杂环乙基(thiaranyl)、吖丙啶基、氧杂环丁基、硫杂环丁基(thiatanyl)、氮杂啶基、四氢呋喃基、四氢苯硫基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃、哌啶基、1，4-二氧六环、1，4-氧硫杂环己基、吗啉基、1，4-二噻烷基、哌嗪基、1，4-氮杂硫化环戊基、环氧己基、硫杂环庚基、氮杂环庚基、1，4-二环氧己基、1，4-氧硫杂环庚基、1，4-氧氮杂环庚基、1，4-二硫杂环庚基、1，4-硫氮杂环庚基和1，4-二氮杂环庚基。杂环烷基可以是C连接或N连接，即其可经碳原子或经氮原子连接剩余分子。
术语“杂烯基”包括烯基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个烯基碳原子。杂烯基可以是C连接或杂连接，即其可经碳原子或经O、S(O)q或N连接剩余分子。
术语“杂环烯基”包括环烯基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个环烯基碳原子。杂环烯基示例包括3，4-二氢-2H-吡喃基、5-6-二氢-2H-吡喃基、2H-吡喃基，1，2，3，4-四氢吡啶和1，2，5，6-四氢吡啶。杂环烯基可以是C连接或N连接，即其可经碳原子或经氮原子连接剩余分子。
术语“杂炔基”包括炔基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个炔基碳原子。杂炔基可以是C连接或杂连接，即其可经碳原子或经O、S(O)q或N连接剩余分子。
术语“杂环炔基”包括环炔基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个环炔基碳原子。杂环炔基可以是C连接或N连接，即其可经碳原子或经氮原子连接剩余分子。
术语“杂亚烷基”包括亚烷基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个亚烷基碳原子。
术语“杂亚烯基”包括亚烯基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少一个亚烯基碳原子。
术语“杂亚炔基”包括亚炔基，其中多至3个碳原子、在一个实施方式中多至2个碳原子、在另一个实施方式中1个碳原子各自独立由O、S(O)q或N取代，只要保留至少个亚炔基碳原子。
芳基
术语“芳基”包括单价、芳族、环烃基基团，如苯基或萘基(如1-萘基或2-萘基)。一般，所述芳基可以是单环或多环融合环芳族基团。优选的芳基是C6-C14芳基。
其他芳基示例是醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊蓝、
Figure BDA00003110182800251
六苯并苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、迫苯并萘、菲、二萘品苯、七曜烯、芘、吡蒽和玉红省的单价衍生物。
术语“芳基烷基”指取代有芳基的烷基，如苯基。
术语“亚芳基”包括二价芳族、环烃基基团，如亚苯基。一般，亚芳基可以是单环或多环融合环芳族基团。优选的亚芳基是C6-C14亚芳基。其他亚芳基示例是醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊蓝、
Figure BDA00003110182800252
、六苯并苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚、萘、卵苯、二萘嵌苯、迫苯并萘、菲、二萘品苯、七曜烯、芘、吡蒽和玉红省的二价衍生物。
杂芳基
术语“杂芳基”包括单价、杂芳族、环烃基基团，额外含一个或多个独立选自O、S、N和NRN的杂原子，其中RN如下定义(且在一个实施方式中是H或烷基(如C1-6烷基))。
一般，所述杂芳基可以是单环或多环(如双环)融合环杂芳族基团。在一个实施方式中，杂芳基包含5-13个环成员(优选5-10个成员)且1、2、3或4个环杂原子独立选自O、S、N和NRN。在一个实施方式中，杂芳基可以是5、6、9或10元，如5元单环、6元单环、9元融合环双环或10元融合环双环。
单环杂芳族基团包括含5-6个环成员和1、2、3或4个选自O、S、N或NRN的杂原子的杂芳族基团。
在一个实施方式中，5元单环杂芳基包含1个环成员，所述环成员为-NRN-基团、-O-原子或-S-原子，和任选的1-3个环成员(如1或2个环成员)，所述环成员为＝N-原子(其中5个环成员的剩余部分是碳原子)。
5元单环杂芳基示例是吡咯基、呋喃基、苯硫基、吡唑基、咪唑基、异
Figure BDA00003110182800261
唑基、氧氮茂基、异噻唑基、噻唑基、1，2，3三唑基、1，2，4三唑基、1，2，3
Figure BDA00003110182800262
二唑基、1，2，4
Figure BDA00003110182800263
二唑基、1，2，5
Figure BDA00003110182800264
二唑基、1，3，4
Figure BDA00003110182800265
二唑基、1，3，4噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1，3，5三嗪基、1，2，4三嗪基、1，2，3三嗪基和四唑基。
6元单环杂芳基示例是吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。
在一个实施方式中，6元单环杂芳基包含1或2个环成员，所述环成员为＝N-原子(其中6个环成员的剩余部分是碳原子)。
双环杂芳族基团包括含9-13个环成员和1、2、3、4或更多个选自O、S、N或NRN的杂原子的融合环杂芳族基团。
在一个实施方式中，9元双环杂芳基包含1个环成员，所述环成员为-NRN-基团、-O-原子或-S-原子，和任选的1-3个环成员(如1或2个环成员)，所述环成员为＝N-原子(其中9个环成员的剩余部分是碳原子)。
9元融合环双环杂芳基的示例是苯并呋喃基、苯并苯硫基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯[2，3-b]吡啶基、吡咯[2，3-c]吡啶基、吡咯[3，2-c]吡啶基、吡咯[3，2-b]吡啶基、咪唑并[4，5-b]吡啶基、咪唑并[4，5-c]吡啶基、吡唑并[4，3-d]吡啶基、吡唑并[4，3-c]吡啶基、吡唑并[3，4-c]吡啶基、吡唑并[3，4-b]吡啶基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、吲哚啉(indolininyl)、咪唑并[1，2-a]吡啶基、咪唑并[1，5-a]吡啶基、吡唑并[1，2-a]吡啶基、吡咯[1，2-b]哒嗪基和咪唑并[1，2-c]嘧啶基。
在一个实施方式中，10元双环杂芳基包含1-3个环成员，所述环成员为＝N-原子(其中10个环成员的剩余部分是碳原子)。
10元融合环双环杂芳基的示例是喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹
Figure BDA00003110182800266
啉基、酞嗪基、1，6-萘啶基、1，7-萘啶基、1，8-萘啶基、1，5-萘啶基、2，6-萘啶基、2，7-萘啶基、吡啶并[3，2-d]嘧啶基、吡啶并[4，3-d]嘧啶基、吡啶并[3，4-d]嘧啶基、吡啶并[2，3-d]嘧啶基、吡啶并[2，3-b]吡嗪、吡啶并[3，4-b]吡嗪、嘧啶并[5，4-d]嘧啶基、吡嗪并[2，3-b]吡嗪和嘧啶并[4，5-d]嘧啶基。
术语“杂芳基烷基”指取代有杂芳基的烷基。
术语“杂亚芳基”包括二价杂芳族、环烃基基团，额外含一个或多个独立选自O、S、N和NRN的杂原子，其中RN如下定义(且在一个实施方式中是H或烷基(如C1-6烷基))。一般，所述杂亚芳基可以是单环或多环(如双环)融合环杂芳族基团。在一个实施方式中，杂亚芳基包含5-13个环成员(优选5-10个成员)且1、2、3或4个环杂原子独立选自O、S、N和NRN。在一个实施方式中，杂亚芳基可以是5、6、9或10元，如5元单环、6元单环、9元融合环双环或10元融合环双环。术语“杂亚芳基”包括上述各杂芳基的二价衍生物。
术语“芳基”、“芳族”、“杂芳基”和“杂芳族”还包括部分还原的基团。因此，例如，“杂芳基”包括融合种类，其中一个环还原成饱和环(如1，2，3，4-四氢-1，8-萘啶-2-基)。
概述
除非另有明确说明，基团组合在本文中称为一个部分如芳基烷基时，最后一个提及的基团包含所述部分通过其结合剩余分子的原子。
提及烷基或其他基团的碳原子由O、S(O)q、N或P(O)r取代时，用于指：
Figure BDA00003110182800271
取代(其中E不能是H)；
-CH＝由-N＝或-P(O)r＝取代；
≡C-H由≡N或≡P(O)r取代；或
-CH2-由-O-、-S(O)q-、-NRN-或P(O)rRN-取代，其中RN是H或可选取代的C1-6烷基、C1-6杂烷基、C3-6环烷基、C3-6杂环烷基、C2-6烯基、C2-6杂烯基、C3-6环烯基、C3-6杂环烯基、苯基、或者含5或6个环原子的杂芳基。RN优选是H、C1-6烷基或C3-6环烷基。
q独立地是0、1或2。在一个实施方式中，q是0。
r独立地是0或1。在一个实施方式中，r是0。
提到碳原子由Si取代时，用于指碳原子交换硅原子但所述键另外保持相同。因此，例如，-CH2-由-SiH2-取代；-CH＝由-SiH＝取代；且≡C-H由≡Si-H取代。
澄清起见，关于上述含杂原子的基团(如杂烷基等)，给出一定数值碳原子例如C3-6杂烷基时，用于指基于C3-6烷基的基团，其中3-6个链碳原子中的一个或多个由O、S(O)q或N取代。因此，C3-6杂烷基会例如包含少于3-6个链碳原子。另一示例中，吡啶基团会分类为C6杂芳基，即使其含有5个碳原子。
取代
本发明的化合物基团(如烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基、杂炔基、杂亚烷基、杂亚烯基芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基杂烷基等)可被取代或未取代，在一个实施方式中未取代。通常，取代涉及用取代基团概念性取代氢原子，或在＝O取代情况中为2个氢原子。
取代时，一般各基团上有1-5个取代基，在一个实施方式中为1-3个取代基，在一个实施方式中为1或2个取代基，在一个实施方式中为1个取代基。一个实施方式包括相同原子如乙缩醛基团上大于一个取代基。
在一个实施方式中，所述取代基独立地是Sub1或Sub2(在一个实施方式中为Sub2)，其中：
Sub1独立地是卤素、三卤甲基、三卤乙基、-NO2、-CN、-N+(Rs)2O-、-CO2H、-CO2Rs、-SO3H、-SORs、-SO2Rs、-SO3Rs、-OC(＝O)ORs、-C(＝O)H、-C(＝O)Rs、-OC(＝O)Rs、＝O、-NRs 2、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NRs 2、-N(Rs)C(＝O)ORs、-N(Rs)C(＝O)NRs 2、-OC(＝O)NRs 2、-N(Rs)C(＝O)Rs、-C(＝S)NRs 2、-NRsC(＝S)Rs、-SO2NRs 2、-NRsSO2Rs、-N(Rs)C(＝S)NRs 2、-N(Rs)SO2NRs 2、-Rs或-ZsRs，其中；
Zs独立地是O，S或NRs；
Rs独立地是H或C1-6烷基，C1-6杂烷基，-(Alka)f-C3-6环烷基，-(Alka)f-C3-6杂环烷基，C2-6烯基，C2-6杂烯基，-(Alka)f-C3-6环烯基，-(Alka)f-C3-6杂环烯基，C2-6炔基，C2-6杂炔基，-(Alka)f-C6-14芳基，-(Alka)f-C6-14芳基或-(Alka)f-杂芳基(其中杂芳基包含5-13个环成员)，其中
f是0或1；
Alka是C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基；和
Rs可选由1-3个取代基Sub2自身取代(在一个实施方式中未取代)；
Sub2独立地是卤素、三卤甲基、三卤乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(＝O)OC1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)N(C1-6烷基)2、-OC(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)C1-6烷基、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6杂烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、-C2-6烯基、-C2-6杂烯基、-C3-6环烯基、-C3-6杂环烯基、-C2-6炔基、-C2-6杂炔基、-C6-14芳基、-C5-13杂芳基、-Zt-C1-6烷基、-Zt-C3-6环烷基、-Zt-C2-6烯基、-Zt-C3-6环烯基或-Zt-C2-6炔基；和
Zt独立地是O，S，NH或N(C1-6烷基)。
Sub1中的Rs可选由1-3个取代基Sub2取代时，Sub2未取代。然而，在一个实施方式中，Rs未取代。
在一个实施方式中，Rs是H或C1-6烷基，可选由1-3个取代基Sub2取代。
在一个实施方式中，Sub2独立地是卤素、三卤甲基、三卤乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、-Zt-C1-6烷基或-Zt-C3-6环烷基。
在一个实施方式中，取代的基团为无环(如烷基、杂烷基、烯基等)时，Sub1不是-Rs且Sub2不是-C1-6烷基，-C1-6杂烷基，-C2-6烯基，-C2-6杂烯基，-C2-6炔基或-C2-6杂炔基。
Sub2以外的基团具有至少2个可取代位置时，所述基团可由亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基链(在一个实施方式中含1-6个原子，在另一个实施方式中含3-6个原子，在另一个实施方式中含3-4个原子)的2个末端取代形成环部分。所述链可选由1-3个取代基Sub2取代。在一个实施方式中，所述链未取代。因此，术语可选取代的“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“杂环烷基”、“杂环烯基”、“杂环炔基”、“芳基”和“杂芳基”包括融合种类。例如，“可选取代的环烷基”包括融合2个环烷基环的种类，“可选取代的杂芳基”包括杂环烷基环融合芳族环的种类(如5，6，7，8-四氢-1，8-萘啶-2-基)。
Sub2以外的基团具有可取代2次的原子时，所述原子可由亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基链(在一个实施方式中含2-8个原子，在另一个实施方式中含3-6个原子，在另一个实施方式中含4-5个原子)的2个末端取代形成环部分。所述链可选由1-3个取代基Sub2取代。在一个实施方式中，所述链未取代。因此，术语可选取代的“环烷基”、“环烯基”、“环炔基”、“杂环烷基”、“杂环烯基”、“杂环炔基”、“芳基”和“杂芳基”包括螺种类。
澄清起见，基团具有杂原子时，取代基可结合杂原子。因此，例如，“可选取代的杂烷基”包括-CH2-N(Sub1)-CH2-，-CH(Sub1)-NH-CH2-和-CH(Sub1)-N(Sub1)-CH2-等。
修饰语术语
列表前有修饰语时，旨在所述修饰语应理解为用于所述列表中的各个项目。例如，短语“可选取代的C3-20-杂环烷基、C3-20-杂环烯基，C3-20-杂环炔基或C5-20-杂芳基”指所述列表中名为C3-20-杂环烷基、C3-20-杂环烯基，C3-20-杂环炔基和C6-20-杂芳基的4种物质各自可选进行取代。
基团由第一修饰语表征且随后同一基团由后续修饰语表征时，用于指所述基团同时由2个修饰语表征。例如，如果基团描述为“C3-20-杂环炔基”(第一修饰语)基团且随后同一基团描述为“C5-16”(后续修饰语)基团，用于指C5-16杂环炔基。
类固醇
本文所用的术语“类固醇”指含下列结构的任何基团(所述结构在本文中称为“类固醇骨架”)。
Figure BDA00003110182800301
仅出于说明目的，上面画出的类固醇骨架为充分饱和。然而，术语类固醇还意在涵盖类固醇骨架不饱和的情况。例如，术语类固醇涵盖含完全不饱和(满环)基本骨架的基团15H-环戊二烯并[a]菲：
Figure BDA00003110182800302
术语类固醇还涵盖含部分不饱和类固醇骨架的基团。
术语类固醇还涵盖类固醇骨架的“裂环”衍生物，即环切割受到影响的基团；分别涉及环收缩和扩张的类固醇骨架“缩环”和“增环”衍生物(参见SystemicNomenclature of Organic Chemistry(《有机化学系统命名法》)，D.Hellwinkel，施普林格出版公司(Springer)出版，2001，ISBN：3-540-41138-0，“裂环”参见第203页且“缩环”和“增环”见第204页)。然而，在一个实施方式中，术语“类固醇”不包括这种裂环衍生物。在另一个实施方式中，术语“类固醇”不包括这种缩环衍生物。在另一个实施方式中，术语“类固醇”不包括这种增环衍生物。因此，在一个实施方式中，术语“类固醇”不包括这种裂环、缩环和增环衍生物。
术语类固醇还涵盖标记为类固醇骨架的结构中一个或多个碳原子由杂原子取代的情况。在一个这种实施方式中多至6个碳原子，在一个实施方式中多至5个碳原子，在另一个实施方式中多至4个碳原子，在另一个实施方式中多至3个碳原子，在另一个实施方式中多至2个碳原子，在另一个实施方式中1个碳原子，各自独立地由O、S(O)q、N、P(O)r或Si(且优选O、S(O)q或N)取代。然而，在一个实施方式中，术语“类固醇”包含“类固醇基本骨架”不含杂原子的种类。
类固醇环系根据下述本发明编号。
Figure BDA00003110182800311
术语类固醇涵盖固醇、类固醇激素、胆酸和胆酸盐。固醇是A环位置3处有羟基的任何类固醇。
不饱和
根据标准应用，Ω-3位置指离链(甲基)末端的第三键；Ω-6位置指离链(甲基)末端的第六键且Ω-9位置指离链(甲基)末端的第九键。
概述
除非另有说明，本发明实施会采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学常规方法。这些技术在文献中已充分解释。参见例如参考文献33-39等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如，“包含”X的组合物可仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
提及电荷、阳离子、阴离子、两性离子等时，取pH7。
TLR3是Toll样受体3。其是在启动免疫系统中起关键作用的单次跨膜受体。已知的TLR3激动剂包括聚(I∶C)。“TLR3”是编码此受体基因的经批准HGNC名称，其专一HGNC ID是HGNC：11849。人TLR3基因的RefSeq序列是GI：2459625。
TLR7是Toll样受体7。其是在启动免疫系统中起关键作用的单次跨膜受体。已知的TLR7激动剂包括例如咪喹莫特。“TLR7”是编码此受体基因的经批准HGNC名称，其专一HGNC ID是HGNC：15631。人TLR7基因的RefSeq序列是GI：67944638。
TLR8是Toll样受体8。其是在启动免疫系统中起关键作用的单次跨膜受体。已知的TLR8激动剂包括例如瑞喹莫德。“TLR8”是编码此受体基因的经批准HGNC名称，其专一HGNC ID是HGNC：15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI：20302165。
RIG-I样受体(“RLR”)家族包括在启动免疫系统中起关键作用的多种RNA解旋酶[40]。RLR-1(也称为RIG-I或视黄酸诱导型基因I)在其N末端附近有胱冬酶招募结构域。编码RLR-1解旋酶基因的经批准HGNC名称是“DDX58”(用于DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽58)且专一HGNC ID是HGNC：19102。人RLR-1基因的RefSeq序列是GI：77732514。RLR-2(也称为MDA5或黑色素瘤分化相关基因5)在其N末端附近有2个胱冬酶招募结构域。编码RLR-2解旋酶基因的经批准HGNC名称是“IFIHI”(用于解旋酶C结构域1诱导的干扰素)且专一HGNCID是HGNC：18873。人RLR-2基因的RefSeq序列是GI：27886567。RLR-3(也称为LGP2或遗传学和生理学实验室蛋白2)没有胱冬酶招募结构域。编码RLR-3解旋酶基因的经批准HGNC名称是“DHX58”(用于DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽58)且专一HGNC ID是HGNC：29517。人RLR-3基因的RefSeq序列是GI：149408121。
PKR是双链RNA依赖性蛋白激酶。其在启动免疫系统中起关键作用。“EIF2AK2”(用于真核翻译起始因子2-α激酶2)是编码该酶基因的经批准HGNC名称，且其专HGNC ID是HGNC：9437。人PKR基因的RefSeq序列是GI：208431825。
附图简要说明
图1显示有染色RNA的凝胶。泳道显示(1)标记物(2)裸露复制子(3)RNA酶处理后的复制子(4)脂质体中包封的复制子(5)RNA酶处理后的脂质体(6)RNA酶处理然后进行苯酚/氯仿提取的脂质体。
图2是脂质体的电子显微照片。
图3显示递送脂质体中RNA后第1、3和6天的蛋白表达(作为相对光单位RLU)，用不同长度的PEG：1kDa(三角形)；2kDa(圆形)；3kDa(正方形)。
图4显示有染色RNA的凝胶。泳道显示(1)标记物(2)裸露复制子(3)脂质体中包封的复制子(4)RNA酶处理然后进行苯酚/氯仿提取的脂质体。
图5显示递送RNA后第1、3和6天的蛋白表达，所述RNA作为病毒粒子包装的复制子(正方形)、裸露RNA(菱形)、或在脂质体中(+＝0.1μg，x＝1μg)。
图6显示递送4种不同剂量的脂质体包封RNA后第1、3和6大的蛋白表达。
图7显示接受病毒粒子包装的复制子(VRP或VSRP)、1μg裸露RNA和1μg脂质体包封RNA的动物中的抗F IgG效价。
图8显示接受VRP、1μg裸露RNA、和0.1g或1μg脂质体包封RNA的动物中的抗F IgG效价。
图9显示接受VRP或者0.1g或1μg脂质体包封RNA的动物中的中和抗体效价。
图10显示递送复制子后的蛋白表达，所述复制子作为裸露RNA(圆形)、脂质体包封RNA(三角形和正方形)、或作为脂复合体(倒三角形)。
图11显示递送复制子后的F特异性IgG效价(第二剂量后2周)，所述复制子作为裸露RNA(0.01-1μg)、脂质体包封RNA(0.01-10μg)、或包装为病毒粒子(VRP，106传染单位或IU)。
图12显示递送复制子后的F特异性IgG效价(圆形)和PRNT效价(正方形)，所述复制子作为裸露RNA(1μg)、脂质体包封RNA(0.1或11μ)、或包装为病毒粒子(VRP，106IU)。还显示未处理的小鼠的效价。实线显示几何平均值。
图13显示第二剂量后4周用代表F蛋白中主要表位的合成肽再刺激后的胞内细胞因子生成。y轴显示％细胞因子+％CD8+CD4-。
图14显示脂质“RV05”的结构。
图15显示免疫小牛后210天的F特异性IgG效价(平均log10效价±标准偏差)。3条线在第63天容易区分，从底部到顶部为：PBS阴性对照；脂质体递送的RNA；和“三角形4”产物。
图16显示3种PEG偶联DMG脂质的结构(1-3kDa)。
图17A-17E显示多种PEG偶联脂质的结构，其中R是有所需长度的PEG。
图18显示有用的“分裂”PEG偶联脂质的结构。框显示脂质中PEG的总MW(在下面的特定示例中为2000)。
具体实施方式
RNA复制子
下面使用多个复制子。一般，这些基于杂交甲病毒基因组，所述基因组有来自委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的非结构蛋白、来自VEEV的包装信号、和来自辛德毕斯病毒或VEEV突变体的3′UTR。所述复制子长约10kb且具有聚A尾。
编码甲病毒复制子的质粒DNA(名为：pT7-mVEEV-FL.RSVF或A317;pT7-mVEEV-SEAP或A306;pSP6-VCR-GFP或A50)用作体外合成RNA的模板。所述复制子包含RNA复制所需的甲病毒遗传元件但缺乏颗粒组装所需的基因产物编码元件；相反结构蛋白由感兴趣的蛋白(报道子如SEAP或GFP，或免疫原如全长RSV F蛋白)取代且因此所述复制子不能诱导感染性颗粒产生。甲病毒cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)促进体外复制子RNA合成且聚(A)尾下游毗邻丁肝病毒(HDV)核酶通过其自身切割活性产生正确3′末端。
HDV核酶下游的质粒DNA用合适限制性内切核酸酶线性化后，失控转录本用T7或SP6噬菌体衍生DNA依赖性RNA聚合酶体外合成。转录在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6 RNA聚合酶)的各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)存在下根据厂商安碧公司(Ambion)提供的说明书于37℃进行2小时。转录后，模板DNA用TURBO DNA酶(安碧公司)消化。所述复制子RNA用LiCl沉淀并在无核酸酶的水中重建。未加帽RNA用ScriptCap m7G通过牛痘加帽酶(VCE)在转录后加帽，如用户手册所概括；对此方法中加帽的复制子给予“v”前缀，如vA317是由VCE加帽的A317复制子。转录后加帽的RNA用LiCl沉淀并在无核酸酶的水中重建。RNA样品浓度通过测量OD260nm来确定。体外转录本的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳来确认。
脂质体包封
RNA包封在基本通过参考文献7和41的方法制备的脂质体中。所述脂质体由10％ DSPC(两性离子)、40％ DlinDMA(阳离子)、48％胆固醇和2％PEG偶联的DMG构成。这些比例指总脂质体中的％摩尔。
DlinDMA(1，2-二亚油醇氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷)用参考文献2的过程合成。DSPC(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)购自(健赞(Genzyme))。胆固醇获自(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。PEG偶联的DMG(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙氨醇-N-[甲氧基(聚乙二醇)铵盐)、DOTAP(1，2-二油酰-3-三甲胺-丙烷，氯盐)和DC-chol(3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]盐酸胆固醇)来自阿凡提脂质公司(Avanti Polar Lipids)。
简言之，脂质溶于乙醇(2ml)，RNA复制子溶于缓冲液(2ml，100mM柠檬酸钠，pH6)且这些混合2ml缓冲液然后平衡1小时。所述混合物用6ml缓冲液稀释，然后过滤。得到的产物包含脂质体，有～95％包封效率。图2显示由这些方法制备的脂质体示例性电子显微照片。这些脂质体包含编码全长RSV F抗原的包封RNA。一个批次的动态光散射显示141nm(强度)或78nm(数量)的平均直径。
在一个特定包封方法中，制备溶于乙醇的新鲜脂质储液。37mg DlinDMA、11.8mg DSPC、27.8mg胆固醇和807mg PEG偶联的DMG进行称重并溶于7.55mL乙醇。使用5种不同的偶联PEG：PEG-500、PEG-750、PEG-1000、PEG-2000或PEG-3000。新鲜制备的脂质储液在37℃温和摇晃约15分钟形成均匀混合物。然后，向1.773mL乙醇中加入226.7μL储液以制备2mL工作脂质储液。还从溶于100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)的～1μg/μL储液制备2mL RNA工作溶液。3个20mL小玻璃瓶(有搅拌棒)用RNA酶清除溶液冲洗并用大量MilliQ水洗涤，然后用于净化RNA酶小瓶。1个小瓶用于RNA工作溶液且其他用于收集脂质和RNA混合物(如后所述)。工作脂质和RNA溶液在37℃加热10分钟，然后加载到3cc鲁尔接口注射器。2mL柠檬酸盐缓冲液(pH6)加载到另一3cc注射器。含RNA和脂质的注射器连接T混合器(PEEKTM500μm ID连接器)，使用FEP管道(氟化乙烯丙烯;所用的全部FEP管道有2mm内径和3mm外径;获自艺达思健康科学公司(Idex Health Science))。T混合器的出口还是FEP管道。含柠檬酸盐缓冲液的第三注射器连接单独管道段。然后，所有注射器用注射器泵以7毫升/分钟流速驱动。放置所述管出口以在20mL小玻璃瓶中收集混合物(同时搅拌)。取出搅拌棒且所述乙醇/水溶液能平衡至室温1小时。然后，所述混合物加载到适合FEP管道段的5cc注射器和有等同长度FEP管道的另一5cc注射器，加载等体积的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。2个注射器用注射器泵以7毫升/分钟流速驱动且最终混合物在20mL小玻璃瓶中收集(同时搅拌)。其次，脂质体浓缩至2mL并用切向流动过滤(TFF)系统相对10-15体积的1XPBS透析，然后移出终产物。TFF系统和中空纤维滤膜购自仕必纯公司(Spectrum Labs)并根据厂商指南使用。使用有100kD截留孔径和20em2表面积的中空纤维滤膜。对于体外和体内实验，制剂用1XPBS稀释到所需RNA浓度。
包封RNA的百分数和RNA浓度通过Quant-iT RiboGreen RNA试剂试剂盒(英杰公司(Invitrogen))遵循厂商说明书测定。所述试剂盒中提供的核糖体RNA标准用于产生标准曲线。脂质体在1XTE缓冲液(来自试剂盒)中稀释10x或100x，然后加入染料。脂质体在含0.5％曲通(Triton)X的1XTE缓冲液中分开稀释10x或100x，然后加入染料(以破坏脂质体并因而测定总RNA)。之后向各溶液加入等量染料，接着～180μL各溶液在染料加入后一式两份加载到96孔组织培养板中。荧光(Ex485nm，Em528nm)在微孔板读取仪上读取。所有脂质体制剂根据包封RNA量体内给药。
为获得较小脂质体，注射器/管方法由脂质和RNA溶液在微流体芯片的通道中混合的方法所替代。制备溶于乙醇的新鲜脂质储液。37mg DlinDMA、11.8mgDSPC、27.8mg胆固醇和8.07mg PEG偶联的DMG进行称重并溶于7.55mL乙醇。新鲜制备的脂质储液在37℃温和摇晃约15分钟形成均匀混合物。然后，向1.773mL乙醇中加入226.7μL储液以制备2mL工作脂质储液。还从溶于100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)的～1μg/μL储液制备4mL RNA工作溶液。4个20mL小玻璃瓶(有搅拌棒)用RNA酶清除溶液冲洗并用大量MilliQ水洗涤，然后用于净化RNA酶小瓶。2个小瓶用于RNA工作溶液(每瓶2mL)且其他用于收集脂质和RNA混合物。工作脂质和RNA溶液在37℃加热10分钟，然后加载到3cc鲁尔接口注射器。含RNA和脂质的注射器连接Mitos液滴连接芯片(获自Syrris的玻璃微流体装置，零件编号3000158)，使用PTFE管道0.03英寸IDx1/16英寸OD，(Syrris)，用4路边缘连接器。2股RNA流和1股脂质流由注射器泵驱动且乙醇与水相的混合在芯片的X结点(100μmx105μm)完成。所有3股流的流速保持在15毫升/分钟，从而总体水与乙醇流速的比例为2∶1。放置所述管出口以在20mL小玻璃瓶中收集混合物(同时搅拌)。取出搅拌棒且所述乙醇/水溶液能平衡至室温1小时。然后，所述混合物加载到适合FEP管道段0.03英寸IDx1/16英寸OD的5cc注射器和有等同长度FEP管道的另一5cc注射器，加载等体积的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。2个注射器用注射器泵以3毫升/分钟流速驱动且最终混合物在20mL小玻璃瓶中收集(同时搅拌)。其次，脂质体浓缩至2mL并用TFF系统相对10-15体积的1XPBS透析，然后移出终产物。使用有100kD截留孔径和20cm2表面积的中空纤维滤膜。对于体外和体内实验，制剂用1XPBS稀释到所需RNA浓度。用75μg RNA通过注射器/管方法制备的脂质体有Z均直径(Zav)148nm和多分散指数(pdI)0.122时，芯片混合产生Zav为97nm且pdI为0.086的脂质体。包封RNA比例从90％稍减至87％。
显示脂质体中包封会保护RNA免于RNA酶消化。实验使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，室温孵育30分钟。RNA酶用蛋白酶K在55℃灭活10分钟。然后加入样品与25∶24∶1v/v/v苯酚∶氯仿∶异戊醇的1∶1v/v混合物以从脂质中提取RNA到水相中。样品通过涡旋数秒来混合并随后放置成以12kRPM离心15分钟。移出水相(含RNA)并用于分析RNA。加载(每孔400ng RNA)前，所有样品用甲醛上样染料孵育，65℃变性10分钟且冷却至室温。Ambion Millennium标记物用于大致接近RNA构建体分子量。所述凝胶在90V运行。所述凝胶用溶于水的0.1％SYBR金根据厂商指南通过室温摇晃1小时来染色。图1显示RNA酶在没有包封时(泳道3)完全消化RNA。RNA在包封后(泳道4)无法检测，且如果这些脂质体用RNA酶处理(泳道4)则没有观察到变化。经RNA酶处理脂质体进行苯酚提取后，观察到未消化RNA(泳道6)。即使在4℃1周后，能观察到RNA而没有任何片段化(图4，箭头)。体内蛋白表达在4℃6周和一轮冻融后没有变化。因此，脂质体包封的RNA稳定。
为评价体内RNA表达，报道子酶(SEAP；分泌型碱性磷酸酶)在复制子中编码，而不是免疫原。表达水平用化学发光碱性磷酸底物在1X Phospha-Light稀释缓冲液中1∶4稀释的血清内测量。8-10周龄BALB/c小鼠(5只/组)在第0天用0.1μg或1μg RNA剂量每腿肌肉内注射50μl。还以1μg给予相同载体而没有脂质体(在无RNA酶的1XPBS中)。还测试病毒粒子包装的复制子。本文所用病毒粒子包装的复制子(称为“VRP”)通过参考文献42的方法获得，其中甲病毒复制子获自突变VEEV或VEEV基因组衍生嵌合体，所述基因组工程改造成包含辛德毕斯病毒3′UTR和辛德毕斯病毒包装信号(PS)，通过将它们共同电穿孔到BHK细胞中来包装，有编码辛德毕斯病毒衣壳的缺陷型辅助RNA和糖蛋白基因。
如图5所示，包封在1μg剂量时使SEAP水平增加约1/2log，来自0.1μg包封剂量的第6天表达与用1μg未包封剂量观察到的水平匹配。第3天表达水平超过用VRP达到的水平(正方形)。因此，RNA在脂质体中配制时表达相对裸露RNA对照增加，即使在低10x剂量。表达还相对VRP对照更高，但表达动力学很不同(见图5)。用电穿孔递送RNA使得表达相对裸露RNA对照增加，但这些水平低于脂质体。
为评价脂质体组中所见效果是否仅缘于脂质体组分或是否与包封相关，所述复制子以包封形式给予(用2种不同纯化操作，0.1μg RNA)或在其形成后混合脂质体(非包封“脂复合体”，0.1μg RNA)或作为裸露RNA(1μg)。图10显示所述脂复合体产生最低表达水平，表明包封对于有效表达关键。
进一步的SEAP实验显示清楚的体内剂量响应，递送少至1ng RNA后观察到表达(图6)。比较包封与裸露复制子表达的其他实验表明0.01μg包封RNA等同于1μg裸露RNA。0.5μg剂量RNA时，包封材料在第6天产生高12倍的表达；0.1μg剂量水平时在第6天高24倍。
还研究个体动物，而不是观察组中的平均水平。数种动物是裸露复制子的无应答者，包封消除了无应答者。
其他实验用DOTAP取代DlinDMA。尽管DOTAP脂质体产生比裸露复制子更好的表达，其次于DlinDMA脂质体(第1天的2-3倍差异)。
为评价体内免疫原性，复制子构建成从呼吸道合胞体病毒(RSV)表达全长F蛋白。这是第0和21天的裸露递送(1μg)、脂质体中包封(0.1或1μg)、或病毒粒子中包装(106IU，“VRP”)。图7显示第二剂量后2周的抗F IgG效价，所述脂质体明显提高免疫原性。图8显示2周后的效价，该点时0.1μg的包封RNA、1μg的包封RNA、或VRP组间没有统计学差异。第二剂量后2周，这3组的中和效价(测量为60％噬斑减少，“PRNT60”)没有显著差异(图9)。图12显示第二剂量后4周的IgG和PRNT效价。
图13确认RNA引起强CD8T细胞反应。
其他实验比较接受VRP、0.1μg脂质体包封RNA、或1μg脂质体包封RNA的小鼠中的F特异性IgG效价。第二剂量后多个时间的效价比例(VRP：脂质体)如下：
2周 4周 8周
0.1μg 2.9 1.0 1.1
1μg 2.3 0.9 0.9
因此，脂质体包封RNA诱导与病毒粒子递送所见基本相同量级的免疫应答。
其他实验显示用10μg剂量的优良F特异性IgG反应，就1μg和0.1μg剂量而言的等同反应，和用0.01μg剂量的较低反应。图11显示接受复制子的小鼠中IgG效价，所述复制子采用3个不同剂量的裸露形式、在4个不同剂量的脂质体中、或作为VRP(106IU)。用1μg脂质体包封RNA观察到的反应与VRP相比时在统计上不显著(ANOVA)，但用10μg脂质体包封RNA观察到的反应与这2组相比时在统计上显著(p＜0.05)。
进一步的研究确认0.1μg脂质体包封RNA产生比0.1μg递送DNA高许多的抗F IgG反应(第二剂量后15天)，甚至比20μg编码F抗原的质粒DNA免疫原性更高，由电穿孔(ElgenTM DNA递送系统，Inovio公司)递送。
脂质体制造方法
般，8种不同方法已用于制备本发明所述脂质体。这些在正文中称为方法(A)-(H)且其差异主要在过滤和TFF步骤方面。详情如下：
(A)制备溶于乙醇的新鲜脂质储液。37mg DlinDMA、11.8mg DSPC、27.8mg胆固醇和8.07mg PEG偶联的DMG 2000进行称重并溶于7.55mL乙醇。新鲜制备的脂质储液在37℃温和摇晃约15分钟形成均匀混合物。然后，向1.245mL乙醇中加入755μL储液以制备2mL工作脂质储液。所述脂质量用于形成有250μg RNA的脂质体。还从溶于100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)的～1μg/μL储液制备2mLRNA工作溶液。3个20mL小玻璃瓶(有搅拌棒)用RNA酶清除溶液(加利福尼亚州圣地亚哥的MBP公司(Molecular BioProducts))冲洗并用大量MilliQ水洗涤，然后用于净化RNA酶小瓶。1个小瓶用于RNA工作溶液且其他用于收集脂质和RNA混合物(如后所述)。工作脂质和RNA溶液在37℃加热10分钟，然后加载到3cc鲁尔接口注射器。2mL柠檬酸盐缓冲液(pH6)加载到另一3cc注射器。含RNA和脂质的注射器连接T混合器(PEEKTM500μm ID连接器，华盛顿州奥克港的艺达思健康科学公司)，使用FEP管道(氟化乙烯丙烯，所用的全部FEP管道有2mm内径x3mm外径，由艺达思健康科学公司提供)。T混合器的出口还是FEP管道。含柠檬酸盐缓冲液的第三注射器连接单独管道段。然后，所有注射器用注射器泵以7毫升/分钟流速驱动。放置所述管出口以在20mL小玻璃瓶中收集混合物(同时搅拌)。取出搅拌棒且所述乙醇/水溶液能平衡至室温1小时。然后，将4ml混合物加载到连接FEP管道段的5cc注射器和连接等同长度FEP管道的另一5cc注射器，加载等量的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。2个注射器用注射器泵以7毫升/分钟流速驱动且最终混合物在20mL小玻璃瓶中收集(同时搅拌)。其次，从第二混合步骤收集的混合物(脂质体)通过Mustang Q膜(结合并移出阴离子分子的阴离子交换支持物，获自美国密歇根州安阿伯的颇尔公司(PallCorporation))。通过脂质体前，4mL 1M NaOH、4mL 1M NaCl和10mL 100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)连续通过Mustang膜。脂质体在通过所述膜前于37℃加温10分钟。接着，脂质体浓缩至2mL并用TFF系统相对10-15体积的1XPBS透析，然后移出终产物。TFF系统和中空纤维滤膜购自仕必纯公司并根据厂商指南使用。使用有100kD截留孔径和8cm2表面积的聚砜中空纤维滤膜(零件编号P/N：X1AB-100-20P)。对于体外和体内实验，制剂用1XPBS稀释到所需RNA浓度。
(B)如方法(A)，除了摇晃后向1.773mL乙醇中加入226.7μL储液以制备2mL工作脂质储液，从而修改脂质：RNA比例。
(C)如方法(B)，除了省略Mustang过滤，因此脂质体从20mL小玻璃瓶进入TFF透析。
(D)如方法(C)，除了TFF使用有100kD截留孔径和20cm2表面积的聚砜(PES)中空纤维滤膜(零件编号P-C1-100E-100-01N)。
(E)如方法(D)，除了使用Mustang膜，如方法(A)。
(F)如方法(A)，除了省略Mustang过滤，因此脂质体从20mL小玻璃瓶进入TFF透析。
(G)如方法(D)，除了从溶于100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)的～1μg/μL储液制备4mL RNA工作溶液。然后，以相同方式制备4个20mL小玻璃瓶。2个小瓶用于RNA工作溶液(每瓶2mL)且其他用于收集脂质和RNA混合物，如(C)。含RNA和脂质的注射器连接Mitos液滴连接芯片(获自Syrris的玻璃微流体装置，零件编号3000158)，使用PTFE管道(0.03英寸内径x1/16英寸外径)，用4路边缘连接器(Syrris)，而不是使用T混合器。2股RNA流和1股脂质流由注射器泵驱动且乙醇与水相的混合在芯片的X结点(100μmx105μm)完成。所有3股流的流速保持在1.5毫升/分钟，从而总体水与乙醇流速的比例为2∶1。放置所述管出口以在20mL小玻璃瓶中收集混合物(同时搅拌)。取出搅拌棒且所述乙醇/水溶液能平衡至室温1小时。然后，所述混合物加载到适合FEP管道段的5cc注射器；有等同长度FEP管道的另一5cc注射器，加载等体积的100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6)。2个注射器用注射器泵以3毫升/分钟流速驱动且最终混合物在20mL小玻璃瓶中收集(同时搅拌)。其次，脂质体浓缩至2mL并用TFF相对10-15体积的1XPBS透析，如(D)。
(H)如方法(A)，除了2mL工作脂质储液通过混合120.9μL脂质储液与1.879mL乙醇来制备。同样，T混合器中混合后，来自20mL小瓶的脂质体加载到PierceSlide-A-Lyzer透析盒(赛默飞世尔(Thermo Scientific)，加强型，0.5-3mL容量)并在高压灭菌处理的塑料容器中相对400-500mL1X PBS于4℃透析过夜，然后移出终产物。
RSV免疫原性
将编码RSVF蛋白的vA317自复制复制子给予BALB/c小鼠，每组4或8只动物，通过在第0和21天用单独复制子(1μg)或配制为有DlinDMA(“RV01”)或DOTAP(“RV13”)的脂质体或图14所示脂质(“RV05”)双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μL)。RV01脂质体有40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇和2％PEG-DMG，但RNA量不同。RV05脂质体有40％RV05、10％DSPC、48％胆固醇和2％PEG-DMG，或者60％RV05、38％胆固醇和2％PEG-DMG。RV13脂质体有40％DOTAP、10％DOPE、48％胆固醇和2％PEG-DMG。所有情况中，PEG为PEG-2000(即2kDaPEG)。为了比较，表达相同RSV-F抗原的裸露质粒DNA(20μg)用电穿孔或RV01(10)脂质体(0.1μg DNA)递送。4只小鼠用作未处理的对照组。
脂质体通过方法(A)或方法(B)制备。对于由方法(A)制备的一些脂质体，使用2倍或一半RNA量。Z均颗粒直径和多分散指数为：
RV Zav(nm) pdI 制备
RV01(10) 158.6 0.088 (A)
RV01(08) 156.8 0.144 (A)
RV01(05) 136.5 0.136 (B)
RV01(09) 153.2 0.067 (A)
RV01(10) 134.7 0.147 (A)
RV05(01) 148 0.127 (A)
RV05(02) 177.2 0.136 (A)
RV13(02) 128.3 0.179 (A)
在第14、36和49天收集血清用于抗体分析。在第49天从小鼠收集脾用于T细胞分析。
F特异性血清IgG效价(GMT)如下：
RV 第14天 第36天
裸露DNA质粒 439 6712
裸露A317 RNA 78 2291
RV01(10) 3020 26170
RV01(08) 2326 9720
RV01(05) 5352 54907
RV01(09) 4428 51316
RV05(01) 1356 5346
RV05(02) 961 6915
RV01(10)DNA 5 13
RV13(02) 644 3616
细胞因子阳性且特异于RSV F51-66肽的T细胞比例如下，仅显示统计上显著大于零的数字：
Figure BDA00003110182800431
因此，脂质体制剂相对裸露RNA对照显著提高免疫原性，如F特异性血清IgG效价和T细胞频率增加所测定。用脂质体配制的质粒DNA、或用电穿孔递送的裸露DNA的免疫原性显著低于脂质体配制的自复制RNA。
其他RV01脂质体通过方法(H)制备，再次使用偶联DMG的2kDa PEG，包封150μg RNA(编码RSV表面融合糖蛋白的vA375复制子)或仅包封缓冲液。因此，这些脂质体有40％ DlinDMA、10％ DSPC、48％胆固醇和2％ PEG-DMG。大小和包封如下：
RV Zav(nm) pdI RNA 包封n
RV01(36) 152.1 0.053 + 92.5％
RV01(36) 144 0.13 - -
所述脂质体通过在第0和21天双侧肌肉内注射(每腿50μl)给予BALB/c小鼠(每组10只)。剂量为0.01、0.03、0.1、0.3或1μg。第一或第二注射后2周，F特异性血清IgG和PRNT60效价(GMT)如下：
RV RNA(μg) 2wp1 2wp2 PRNT60(2wp2)
缓冲液对照 0 - - 10
RV01(36) 0 - - 10
RV01(36) 0.01 3399 50691 37
RV01(36) 0.03 3446 53463 83
RV01(36) 0.1 8262 76808 238
RV01(36) 0.3 5913 82599 512
RV01(36) 1 8213 85138 441
巨细胞病毒免疫原性
有DLinDMA作为阳离子脂质和2kDa PEG的RV01脂质体用于递送编码CMV糖蛋白的RNA复制子。“vA160”复制子编码全长糖蛋白H和L(gH/gL)，而“vA322”复制子编码可溶形式(gHsol/gL)。2种蛋白在单个复制子中分开的亚基因组启动子控制下；共给予2个单独载体不产生良好结果，一个载体编码gH且一个编码gL。
每组10只的BALB/c小鼠在第0、21和42天用表达gH/gL的VRP(1x106IU)、表达gHsol/gL的VRP(1x106 IU)和作为对照的PBS进行双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μl)。2个测试组接受1μg vA160或vA322复制子，所述复制子在脂质体(40％DlinDMA、10％ DSPC、48％胆固醇、2％PEG-DMG；用方法(D)，但用150μg RNA批量大小)中配制。
vA160脂质体的Zav直径为168.8nm，pdI为0.144，且有874％包封。vA322脂质体的Zav直径为162nm，pdI为0.131，且有90％包封。
所述复制子能从单个载体表达2种蛋白。
在第63天收集血清用于免疫学分析(3wp3)。CMV中和效价(血清稀释倒数产生相对于对照的每孔阳性病毒灶数量50％减少)如下：
Figure BDA00003110182800441
因此，表达全长或可溶形式CMV gH/gL复合物的RNA引起高效价的中和抗体，如表皮细胞上所测定。脂质体包封RNA引起的平均效价至少与对应VRP一样高。
重复实验确认所述复制子能从单个载体表达2种蛋白。所述RNA复制子产生11457的3wp3效价，与VRP的5516相比较。
表达动力学
表达荧光酶报道基因(luc)的自复制RNA复制子(“vA311”)用于研究注射后蛋白表达的动力学。每组5只动物的BALB/c小鼠在第0天接受以下的双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μl)：
组1表达荧光酶的DNA，用电穿孔递送(10μg)
组2脂质体(40％DlinDMA、10％DSPC、48％胆固醇、2％偶联DMG的PEG-2000)中配制的自复制RNA(1μg)
组3用阳离子纳米乳液(CNE17)配制的自复制RNA(1μg)
组4用不同阳离子纳米乳液配制的自复制RNA(1μg)
组5表达荧光酶的VRP(1x106IU)
疫苗接种前，对小鼠进行脱毛。麻醉小鼠(含2％异氟烷的氧)，首先用电动剃刀然后用化学品奈尔(Nair)移除毛发。随后用Xenogen IVIS 200成像系统(卡尺生命科学(Caliper Life Sciences))在第3、7、14、21、28、35、42、49、63和70天获得生物发光数据。成像前5分钟，小鼠用8mg/kg荧光素溶液腹膜内注射。然后，动物进行麻醉并转至成像系统。图像获取时间保持恒定，因为生物发光信号用制冷CCD相机测量。
视觉方面，发现表达荧光酶的细胞主要保持在RNA注射位点，移出四边形后成像的动物显示没有信号。
数量方面，荧光酶表达测量为70天阶段内的平均辐射(p/s/cm2/sr)，5组的结果如下：
天数 1 2 3 4 5
3 8.69E+07 3.33E+06 2.11E+06 9.71E+06 1.46E+07
7 1.04E+08 8.14E+06 1.83E+07 5.94E+07 1.64E+07
14 8.16E+07 2.91E+06 9.22E+06 3.48E+07 8.49E+05
21 1.27E+07 3.13E+05 6.79E+04 5.07E+05 6.79E+05
28 1.42E+07 6.37E+05 2.36E+04 4.06E+03 2.00E+03
35 1.21E+07 6.12E+05 2.08E+03
42 1.49E+07 8.70E+05
49 1.17E+07 2.04E+05
63 9.69E+06 1.72E+03
70 9.29E+06
用阳离子纳米乳液配制的自复制RNA在第3天显示可测量的生物发光，在第7天达到峰值，然后在第28-35天下降到背景水平。脂质体中配制时，所述RNA在第3天显示可测量的生物发光，第7天达到峰值，第63天下降到背景水平。用VRP递送的RNA显示相较配制RNA在第21天提高生物发光，但表达在第28天下降到背景水平。电穿孔DNA显示在所有测量时间点的最高生物发光水平且生物发光水平在实验70天内不下降到背景水平。
递送体积
流体动力学递送利用快速注射大体积溶液产生的力来克服细胞膜物理屏障，所述屏障防止大和不透膜化合物进入细胞。此现象先前显示对胞内递送DNA疫苗有用。
肌肉内注射的典型小鼠递送体积为后肢50μl，这就小鼠腿肌肉而言是相对较高的体积。相反，～0.5ml的人肌肉内剂量相对较小。如果小鼠的免疫原性是体积依赖性，则复制子疫苗功效可能至少部分是缘于流体动力，这不会鼓励在人和较大动物中应用相同疫苗。
vA317复制子在第0和21天通过双侧肌肉内疫苗接种(每腿5或50)递送给每组10只的BALB/c小鼠：
组1接受裸露复制子，50μL中0.2μg/腿
组2接受裸露复制子，5μL中0.2μg/腿
组3接受乳液配制的复制子(0.2μg，50μL/腿)
组4接受乳液配制的复制子(0.2μg，5μL/腿)
组5接受脂质体配制的复制子(0.2μg，50μL/腿)
组6接受脂质体配制的复制子(0.2μg，5μL/腿)
组5和6的脂质体为40％ DlinDMA、10％ DSPC、48％胆固醇、和2％偶联DMG的PEG-2000。
在第14和35天收集血清用于抗体分析。F特异性血清IgG GMT为：
天数 1 2 3 4 5 6
14 42 21 783 760 2669 2610
35 241 154 2316 2951 17655 18516
因此，配制复制子的免疫原性不根据递送体积变化，从而表明这些RNA疫苗就其功效而言不依赖于流体动力学递送。
棉鼠
对棉鼠(刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidis))而不是小鼠进行研究。1μg剂量时，脂质体包封相较裸露RNA使F特异性IgG效价增加8.3倍和PRNT效价增加9.5倍。抗体反应幅度等同于用5x106IU VRP所诱导。2种裸露和脂质体包封RNA能保护棉鼠免受RSV攻击(1x105斑形成单位)，使肺病毒载量减少至少3.5log。包封使下降增加约2倍。
关于棉鼠的进一步工作使用4个不同复制子：vA317表达全长RSV-F;vA318表达截短(移除跨膜和胞质尾)RSV-F，vA142表达缺失融合肽的RSV-F，vA140表达截短且也没有肽的RSV-F。每组4-8只动物的棉鼠在第0和21天用2个剂量(1.0和0.1μg)的4种不同复制子进行肌肉内疫苗接种(每腿100μL)，所述复制子在用2kDa PEG-偶联DMG通过方法(D)制备的脂质体中配制，但用150μg RNA批量大小。对照组接受有明矾佐剂的RSV-F亚基蛋白疫苗(5μg)(8只动物/组)、表达全长RSV-F的VRP(1x106IU，8只动物/组)、或未处理的对照(4只动物/组)。在第0、21和34天收集血清用于抗体分析。
第21和34天的F特异性血清IgG效价和RSV血清中和抗体效价为：
Figure BDA00003110182800471
此研究评价的所有4个复制子(vA317、vA318、vA142、vA140)由脂质体递送时在棉鼠中为免疫原性，尽管血清中和效价比佐剂化蛋白疫苗或VRP诱导的低至少10倍。所述脂质体/RNA疫苗在第一疫苗接种后引起血清F特异性IgG和RSV中和抗体，第二疫苗接种有效加强反应。用1μg复制子的第二疫苗接种后的F特异性IgG效价比用0.1μg复制子的第二疫苗接种后高2-3倍。所述4个复制子引起相当抗体效价，提示全长和截短RSV-F(各有或没有融合肽)在棉鼠中的免疫原性类似。
关于棉鼠的进一步工作使用vA317、vA318和vA142复制子。每组2-8只动物的棉鼠在第0和21天用复制子(0.1或1μg)进行肌肉内疫苗接种(每腿100μL)，所述复制子包封在用方法(D)制备的RV01脂质体(有PEG-2000)中，但用150μgRNA批量大小。对照组接受有明矾佐剂的RSV-F亚基蛋白疫苗(5μg)、表达全长RSV-F的VRP(1x106IU，8只动物/组)。所有这些动物接受第三疫苗接种(第56天)，用有明矾佐剂的RSV-F亚基蛋白疫苗(5μg)。另外，有未处理的对照(4只动物/组)。另外，额外组在第0和56天用脂质体中1μg vA317RNA进行双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μL)，但未接受用所述亚基蛋白疫苗的第三疫苗接种。
在第0、21、35、56、70天收集血清用于抗体分析，就额外组而言加上第14，28和42天。F特异性血清IgG效价(GMT)如下：
Figure BDA00003110182800481
血清中和效价如下(用于每组3-4只动物的2个库的60％RSV中和效价，每组这2个库的GMT)：
Figure BDA00003110182800482
额外组的血清效价和中和效价如下：
天数 14 21 28 35 42 56 70
IgG 397 561 535 501 405 295 3589
NT 52 82 90 106 80 101 1348
因此，确认复制子在棉鼠中为免疫原性，在第一疫苗接种后引起血清F特异性IgG和RSV中和抗体。第二疫苗接种有效加强反应。用1.0μg复制了的第二疫苗接种后的F特异性IgG效价比用0.1μg复制子的第二疫苗接种后高1.5-4倍。
第三疫苗接种(第56天的蛋白)在先前接种有F三聚体亚基+明矾的棉鼠中不增强效价，但在先前接种有所述复制子的棉鼠中确实提供对效价的大幅加强。大部分情况中，2次复制子疫苗接种接着蛋白加强后的RSV血清中和效价等于或高于2或3次连续蛋白疫苗接种诱导的效价。
此研究还评价对1.0μg vA317的抗体反应动力学。由单次疫苗接种诱导的F特异性血清IgG和RSV中和效价在约第21天达到其峰值，维持到至少第56天(F特异性IgG效价下降50-70％，RSV中和效价变化较小)。同源第二疫苗接种在第56天给予这些动物，且使抗体效价加强到与第21天给予第二疫苗接种时所达到的至少等同水平。
其他实验涉及病毒攻击。vA368复制子编码缺失融合肽的RSV全长野生型表面融合糖蛋白，表达由EV71IRES驱动。每组7只的棉鼠在第0和21天用脂质体中vA368或有相同复制子的VRP进行肌肉内疫苗接种(每腿100μL)，所述脂质体用方法(H)，175μg RNA批量大小制备。所述脂质体包括偶联DMG的2kDa PEG。对照组接受5μg有明矾佐剂的蛋白，也包括未处理的对照组。
所有组在最终免疫后4周接受用1x106PFU RSV的鼻内攻击(i.n.)。在第0、21、35天收集血清用于抗体分析。病毒肺效价在攻击后5天测量。结果如下：
Figure BDA00003110182800491
因此，所述RNA疫苗使肺病毒载量减少3个log，从未接种疫苗的对照棉鼠中约106PFU/g到小于接种疫苗的对照棉鼠中103PFU/g。
大型哺乳动物研究
大型动物研究在牛中进行。牛(4-6周龄，～60-80kg，每组5只)在第0、21、86和146天用66μg编码全长RSV F蛋白的复制子vA317免疫。所述复制子在通过方法(E)但用1.5mg RNA批量大小制备的脂质体内配制；其有40％ DlinDMA、10％ DSPC、48％胆固醇、2％偶联DMG的PEG-2000。单独PBS用作阴性对照，许可疫苗用作阳性对照(来自富道(Fort Dodge)的“Triangle4(三角4)”，包含灭活病毒)。所有牛在第146天接受有MF59乳液佐剂的15μg F蛋白。
所述RNA疫苗编码人RSV F，而“Triangle 4”疫苗编码牛RSV F，但RSV F蛋白在BRSV与HRSV之间高度保守。
牛接受2ml的各实验疫苗，各颈侧上肌肉内给予2x1ml。相反，“Triangle4”疫苗以单个2ml剂量在颈部给予。在第0，14，21，35，42，56，63，86，100，107，114，121，128，135，146，160，167，174，181，188，195和202天收集血清用于抗体分析。如果个体动物的效价低于检测极限，赋予其效价5。
图15显示210天内的F特异性IgG效价。前63天中，所述RNA复制子经脂质体在奶牛中为免疫原性，尽管其产生的效价低于许可疫苗。所有接种疫苗的奶牛在第二剂量后显示F特异性抗体，效价在第二剂量后的2-6周阶段很稳定(且就所述RNA疫苗而言特别稳定)。多至第202天的效价如下：
Figure BDA00003110182800501
RSV血清中和抗体效价如下：
用于第二脂质体剂量的材料不是新鲜制备的，同一批RNA显示小鼠免疫原性研究中的效力减少。因此，如果所有疫苗接种使用新鲜材料，可能疫苗的免疫原性会更高。
用补体测定时，在所有接种疫苗的奶牛中检测到中和抗体。此试验中，所有接种疫苗的小牛在第二RNA疫苗接种后有良好中和抗体效价。此外，所述RNA疫苗在第二疫苗接种后的一些小牛中和第三疫苗接种后的所有小牛中引起可检测的F特异性血清IgG效价。
有MF59佐剂的RSV-F能在所有先前接种疫苗的牛中加强IgG反应，并在先前接种有RNA的牛中加强补体非依赖性中和效价。
从小动物模型移到较大动物和人时，根据先前观察到的基于DNA疫苗的效力损失，较大动物中RNA疫苗的构念验证特别重要。牛DNA疫苗的典型剂量是0.5-1mg[43，44]，因此免疫应答仅用66μg RNA诱导很令人鼓舞。
PEG长度效果
如上所述，脂质体用偶联5个不同PEG的DMG制备。PEG的平均分子量为500Da、750Da、1kDa、2kDa或3kDa。
用最短PEG(500Da和750Da)形成的脂质体在TFF纯化中不稳定或聚集。PEG-750产生有显著更高Z均直径(669nm)和多分散指数(0.21)、有77％包封的脂质体。PEG-500脂质体在TFF工艺期间于溶液中明显聚集且实验终止。因此，这些短PEG脂质体不稳定，但更长PEG形成稳定脂质体。
不同PEG长度(图16)对脂质体直径和多分散指数有较小效果。1kDa PEG的Z均直径为197nm(0.119pdI)，2kDa PEG为142nm(0.137pdI)，3kDa PEG为147nm(0.075pdI)。RNA包封随着PEG长度增加而逐步提高，从81.7％到85.9％到91.5％(尽管此关系在随后实验中不总是观察到)。
所述脂质体在第0天通过肌肉内注射给予小鼠。血清SEAP水平在第1、3和6天通过化学发光测定来检测。如图3所示，3种PEG长度都有效，但改变PEG长度对血清SEAP水平有一定效果，PEG 2000产生最高表达。
不同脂质和PEG长度
vA317复制子在有多种不同脂质的脂质体中给予，所述脂质体有不同PEG长度。所述脂质体都有40％ DlinDMA、10％DSPC和48％胆固醇，但剩余2％变化，有不同PEG化脂质(如图17A-17E)和不同PEG长度。
由方法(H)制备的脂质体的物理特征为：
名称 PEG化脂质 PEG长度 Zav(nm) pdI ％包封n
A DMG 2000 136.3 0.087 85.35
B DMG 3000 120.9 0.087 72.06
C DMG 1000 175.9 0.111 92.52
D 图17A 2000 157.9 0.094 97.44
E 图17D 2000 122.2 0.122 77.84
F 图17E 2000 129.8 0.125 82.57
G 胆固醇 2000 122.9 0.087 87.1
H 图17C 2000 138 0.137 78.48
I 图17B 2000 113.4 0.091 89.12
每组8只的BALB/c小鼠在第0和21天用复制子进行双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μL)，所述复制子裸露(1μg)或包封在这些脂质体中(0.1μg)。在第14和35天收集血清用于抗体分析。
2次注射后2周(2wp1)，F特异性血清IgG效价(GMT)如下：
RV 2wp1 2wp2
裸露RNA 216 1356
A 3271 15659
B 3860 22378
C 1691 7412
D 1025 1767
E 1618 9536
F 2684 11221
G 3514 10566
H 4142 22810
I 952 10410
结果显示某一趋势，指示更高分子量PEG头部基团的免疫原性更高。随着DMG-偶联PEG的长度从1000Da增加到3000Da，2wp2F特异性IgG效价从7412增加到15659再到22378。
接头区域从酯变成醚不显著影响效价。同样，在相同分子量的头部基团(2000)，有增加脂质尾长度会降低效价的趋势(有C14二烷基的H相比有C18二烷基的I)。用胆固醇取代PEG二烷基脂质尾对免疫原性影响小(有DMG的A相比有胆固醇的G)。
用不同脂质进行类似实验，其中2kDa PEG分成2x1kDa组(图18，加框区的总MW为2000)。再次使用vA317复制子，每组8只的BALB/c小鼠在第0和21天用1μg裸露RNA或0.1μg脂质体包封RNA进行双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μL)。所述脂质体都有40％阳离子脂质(DlinDMA)、10％DSPC和48％胆固醇，但剩余2％变化，有不同PEG化脂质(但都有2kDa PEG)。其通过方法(H)制备。
所述脂质体的物理特征为：
名称 PEG化脂质 Zav(nm) pdI ％包封n
A DMG 121 0.101 84.84
B 分开;R＝C14饱和 141.3 0.049 95.41
C 分开;R＝C16饱和 114.6 0.101 96.79
D 分开;R＝C18饱和 116.5 0.088 98.63
E 分开;R＝C18，1不饱和 129.4 0.149 93.37
其他脂质体用RV05制备。所述脂质体有40％阳离子脂质(RV05)和2％PEG化DMG(2kDa PEG)，而剩余组分变化(但总是包括胆固醇)。所述脂质体通过方法(H)制备，但用pH5。物理特征为：
Figure BDA00003110182800531
αGC＝α-半乳糖神经酰胺
每组8只的BALB/c小鼠在第0和21天用复制子进行双侧肌肉内疫苗接种(每腿50μL)，所述复制子裸露(1μg)或包封(0.1μg)。在第14和35天收集血清用于抗体分析。2次注射后2周(2wp1)，F特异性血清IgG效价(GMT)如下：
RV 2wp1 2wp2
裸露RNA 321 915
A 2761 17040
B 866 3657
C 1734 5209
D 426 2079
E 2696 15794
F 551 955
G 342 2531
H 1127 3881
I 364 1741
J 567 5679
K 1251 5303
因此，分开PEG头部基团降低体内效价。在PEG脂质尾纳入双键(每烷基尾恢复1度)增加IgG效价，在第14天增加6倍且第35天增加7倍。对于有不对称脂质尾(烷基+胆固醇)的阳离子脂质，将中性脂质从DSPC(饱和C18脂质尾)变成18∶2或18∶3PC(每尾有2和3个不饱和双键)增加总IgG效价。用DPyPE取代DSPC观察到相当结果。
应理解本发明仅通过示例方式描述，可进行修改而仍保持在本发明范围和精神内。
表1：有用的磷脂
DDPC    1，2-二癸酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPA    1，2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DEPC    1，2-芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DEPE    1，2-二芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DEPG    1，2-二芥酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLOPC   1，2-亚油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPA    1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DLPC    1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DLPE    1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DLPG    1，2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DLPS    1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DMG     1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPA    1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DMPC    1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DMPE    1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DMPG    1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DMPS    1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DOPA    1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DOPC    1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DOPE    1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DOPG    1，2-二油酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DOPS    1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPPA    1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DPPC    1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DPPE    1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DPPG    1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DPPS    1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
DPyPE   1，2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPA    1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸盐
DSPC    1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
DSPE    1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
DSPG    1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)
DSPS    1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸
EPC     卵-PC
HEPC    氢化卵PC
HSPC    高纯度氢化大豆PC
HSPC    氢化大豆PC
LYSOPC MYRISTIC 1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC PALMITIC 1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
LYSOPC STEARIC   1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
牛奶鞘磷脂MPPC   1-肉豆蔻酰，2-棕榈酰-sn-甘油3-磷脂酰胆碱
MSPC    1-肉豆蔻酰，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
PMPC    1-棕榈酰，2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPC    1-棕榈酰，2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
POPE    1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺
POPG    1，2-二油酰-sn-甘油-3[磷脂酰-外消旋-(1-甘油)...]
PSPC    1-棕榈酰，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SMPC    1-硬脂酰，2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SOPC    1-硬脂酰，2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
SPPC    1-硬脂酰，2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱
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Claims (12)

1.一种其内包封感兴趣免疫原的编码RNA的脂质体，其中所述脂质体包括含聚乙二醇部分的至少一种脂质，从而聚乙二醇在脂质体外部出现，其中所述聚乙二醇的平均分子量为1kDa-3kDa。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含PEG-DMG和/或具有式(X)的脂质。
3.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体直径范围为80-160nm。
4.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含有阳离子头部基团的脂质。
5.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体包含有两性离子头部基团的脂质。
6.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA是自复制RNA。
7.如权利要求6所述的脂质体，其特征在于，所述自复制RNA分子编码(i)能从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。
8.如权利要求7所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子具有2个开放阅读框，第一开放阅读框编码甲病毒复制酶且第二开放阅读框编码所述免疫原。
9.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述RNA分子长度为9000-12000个核苷酸。
10.如前述权利要求中任一项所述的脂质体，其特征在于，所述免疫原可引起针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的体内免疫应答。
11.一种含前述权利要求中任一项所述脂质体的药物组合物。
12.一种引起脊椎动物中保护性免疫应答的方法，所述方法包含给予脊椎动物有效量的权利要求1-10所述脂质体或权利要求11所述药物组合物的步骤。
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